ਖ਼ਬਰਾਂ

Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ।ਤੁਹਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਜਾ ਰਹੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਸੀਮਿਤ CSS ਸਮਰਥਨ ਹੈ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)।ਇਸ ਦੌਰਾਨ, ਨਿਰੰਤਰ ਸਮਰਥਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ ਜਾਵਾ ਸਕ੍ਰਿਪਟ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਰੈਂਡਰ ਕਰਾਂਗੇ।
ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਸੈਲੂਲਰ ਤਣਾਅ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਨ ਅਤੇ ਤਰੱਕੀ ਜਾਰੀ ਰੱਖਣ ਲਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਵਿਧੀਆਂ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤੀਆਂ ਹਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨੇਜ਼ ਆਰ (ਪੀਕੇਆਰ) ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਐਕਟੀਵੇਟਰ (ਪੀਏਸੀਟੀ) ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਜਵਾਬਦੇਹ ਹਨ ਜੋ ਸੈੱਲ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਅਤੇ ਅਪੋਪਟੋਸਿਸ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਕਈ ਤਣਾਅ ਦੇ ਸੰਕੇਤਾਂ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ PACT-PKR ਮਾਰਗ ਦਾ ਨਿਯਮ ਕਾਫ਼ੀ ਹੱਦ ਤੱਕ ਅਣਜਾਣ ਹੈ।ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਲੰਬੇ ਗੈਰ-ਕੋਡਿੰਗ RNA (lncRNA) aspartyl tRNA ਸਿੰਥੇਟੇਜ਼ ਐਂਟੀਸੈਂਸ RNA 1 (DARS-AS1) ਸਿੱਧੇ PACT-PKR ਮਾਰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।CRISPRi 971 ਕੈਂਸਰ ਨਾਲ ਜੁੜੇ lncRNA ਦੀ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧੇ ਹੋਏ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ।ਇਸ ਲਈ, DARS-AS1 ਨਾਕਆਊਟ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਵਿੱਚ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਮਕੈਨੀਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ, DARS-AS1 PACT ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਡੋਮੇਨ ਨਾਲ ਸਿੱਧਾ ਜੁੜਦਾ ਹੈ ਅਤੇ PACT-PKR ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ, eIF2α ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਐਪੋਪਟੋਟਿਕ ਸੈੱਲ ਦੀ ਮੌਤ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।ਕਲੀਨਿਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ, DARS-AS1 ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਕੈਂਸਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸ lncRNA ਦਾ ਜ਼ਿਆਦਾ ਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਹੋਣਾ ਇੱਕ ਮਾੜੀ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਦਾ ਸੰਕੇਤ ਹੈ।ਇਹ ਅਧਿਐਨ DARS-AS1 lncRNA ਦੁਆਰਾ PACT-PKR ਮਾਰਗ ਦੇ ਕੈਂਸਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਨਿਯਮ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਲਈ ਇੱਕ ਹੋਰ ਟੀਚਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਤਣਾਅ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੋਣ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਬਚਾਅ ਅਤੇ ਫੈਲਣ ਦੀ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੈ।ਕਠੋਰ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣਾਂ ਵਿੱਚ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਸਿਖਰ ਦੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਫੈਲਣ ਅਤੇ ਪਾਚਕ ਲੱਛਣ — ਪੌਸ਼ਟਿਕ ਤੱਤਾਂ ਦੀ ਘਾਟ, ਹਾਈਪੌਕਸਿਆ, ਅਤੇ ਘੱਟ pH — ਜੋ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਦੇ ਸੰਕੇਤ ਮਾਰਗਾਂ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਤਣਾਅ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਜੀਨਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ p535, ਹੀਟ ​​ਸ਼ੌਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 6, 7, KRAS8, 9, ਅਤੇ HIF-110, 11, 12, 13 ਦੇ ਅਸੰਤੁਲਨ ਨੂੰ ਕੈਂਸਰ ਵਿੱਚ ਅਕਸਰ ਦੇਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬਚਾਅ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨੇਜ਼ ਆਰ (PKR) ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ ਇਨੀਸ਼ੀਏਸ਼ਨ ਫੈਕਟਰ 2α (eIF2α) ਦਾ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤਣਾਅ ਸੰਵੇਦਕ ਅਤੇ ਸਬਯੂਨਿਟ ਕਿਨੇਜ਼ ਹੈ, ਇੱਕ ਅਨੁਵਾਦਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰ ਜੋ ਸੈਲੂਲਰ ਤਣਾਅ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਦੀ ਮੌਤ ਨਾਲ ਜੋੜਦਾ ਹੈ।PKR ਨੂੰ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ RNA (dsRNA) ਦੀ ਖੋਜ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਰਗਰਮ ਹੋਣ 'ਤੇ, ਵਾਇਰਲ ਅਤੇ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ 14,15,16 ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ PKR ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟਸ eIF2α।PACT (PKR ਐਕਟੀਵੇਟਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ) ਨੂੰ dsRNA17,18,19,20,21,22,23 ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਪਹਿਲੇ PKR ਐਕਟੀਵੇਟਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਪੀਕੇਆਰ ਨਾਲ ਸਿੱਧੀ ਗੱਲਬਾਤ ਰਾਹੀਂ, ਪੀਏਸੀਟੀ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਣਾਅ (ਸੀਰਮ ਭੁੱਖਮਰੀ, ਪੈਰੋਕਸਾਈਡ ਜਾਂ ਆਰਸੈਨਾਈਟ ਟ੍ਰੀਟਮੈਂਟ) ਨੂੰ ਪੀਕੇਆਰ ਅਤੇ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕਰਦਾ ਹੈ।eIF2α ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, PACT-ਵਿਚੋਲਗੀ ਵਾਲੇ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨਾਲ ਜੁੜੀਆਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਘਟਨਾਵਾਂ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ PI3K/Akt24 ਮਾਰਗ ਦੁਆਰਾ ਬਦਲੀ ਗਈ ਰੈਡੌਕਸ ਸਥਿਤੀ, p5325,26 ਦੁਆਰਾ ਵਧੀ ਹੋਈ DNA ਨੁਕਸਾਨ ਦੀ ਜਾਂਚ ਅਤੇ NF-κB27,28 ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ, ਪ੍ਰਸਾਰ, ਅਪੋਪਟੋਸਿਸ ਅਤੇ ਹੋਰ ਮੁੱਖ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਭੂਮਿਕਾ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, ਪੀਕੇਆਰ ਅਤੇ ਪੀਏਸੀਟੀ ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਬਿਮਾਰੀਆਂ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੈਂਸਰ30,31,32,33 ਲਈ ਇਲਾਜ ਦੇ ਟੀਚੇ ਦਾ ਵਾਅਦਾ ਕਰ ਰਹੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਪਲੀਓਟ੍ਰੋਪਿਕ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਅਤੇ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਮਹੱਤਤਾ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ PACT/PKR ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਾ ਨਿਯਮ ਅਧੂਰਾ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ।
lncRNAs 200 ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਾਂ ਤੋਂ ਵੱਡੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀਆਂ ਹਨ, ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਕੋਡਿੰਗ ਸੰਭਾਵੀ।ਕਿਉਂਕਿ ਅਤਿ-ਆਧੁਨਿਕ ਸਮੁੱਚੀ ਜੀਨੋਮ ਸੀਕਵੈਂਸਿੰਗ ਪ੍ਰੋਜੈਕਟਾਂ ਨੇ ਹਜ਼ਾਰਾਂ lncRNAs ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ, 35,36 ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਕਾਰਜਾਂ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਨ ਲਈ ਬਹੁਤ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਖੋਜ ਦੀ ਇੱਕ ਵਧ ਰਹੀ ਸੰਸਥਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ lncRNAs ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ X-ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਇਨਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ 38,39, ਇਮਪ੍ਰਿੰਟਿੰਗ 40, ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ41,42, ਅਨੁਵਾਦ 43 ਅਤੇ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ ਕੈਂਸਰ ਦਾ ਵਾਧਾ 44,45,46,47 ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦੱਸਿਆ ਕਿ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ lncRNAs PACT/PKR ਮਾਰਗ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਅਜਿਹੇ ਇੱਕ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ lncRNA ASPACT ਨੇ PACT ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਅਤੇ PACT mRNA ਦੀ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਧਾਰਨਾ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ।ਹੋਰ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ lncRNA nc886 PKR ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ 49,50 ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।ਹੁਣ ਤੱਕ, lncRNA ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ PACT-ਵਿਚੋਲੇ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।
Aspartyl-tRNA ਸਿੰਥੇਟੇਜ਼ ਐਂਟੀਸੈਂਸ RNA 1 (DARS-AS1) ਦੀ ਪਛਾਣ ਇੱਕ ਆਨਕੋਜੇਨਿਕ lncRNA51,52,53,54 ਵਜੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।miP-194-5p53, miP-12952 ਅਤੇ miP-532-3p51 ਦੇ ਨਿਯਮ ਦੁਆਰਾ, DARS-AS1 ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸੈੱਲ ਰੇਨਲ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸਿਨੋਮਾ, ਥਾਇਰਾਇਡ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਛੋਟੇ ਸੈੱਲ ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਟੋਂਗ ਅਤੇ ਸਹਿਕਰਮੀਆਂ ਨੇ ਇਹ ਵੀ ਪਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ 39 (RBM39) RNA-ਬਾਈਡਿੰਗ ਮੋਟਿਫ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਕਾਇਮ ਰੱਖ ਕੇ ਮਾਈਲੋਮਾ ਦੀ ਤਰੱਕੀ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਬਾਰੇ ਕੋਈ ਅਧਿਐਨ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਇਹ lncRNA PACT-PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਿਯਮ ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।
ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ CRISPRi ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪੈਮਾਨੇ ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ-ਦੇ-ਫੰਕਸ਼ਨ ਸਕ੍ਰੀਨ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਅਤੇ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਕਿ DARS-AS1 lncRNA ਕਈ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਵਿਧੀ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ: DARS-AS1 PACT ਨਾਲ ਸਿੱਧਾ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, PACT ਅਤੇ PKR ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, eIF2α ਦੇ ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਹੇਠਲੇ PKR ਸਬਸਟਰੇਟ, ਅਤੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਐਪੋਪਟੋਟਿਕ ਸੈੱਲ ਦੀ ਮੌਤ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਸਾਡਾ ਕੰਮ DARS-AS1 lncRNA ਨੂੰ PACT-PKR ਮਾਰਗ ਦੇ ਇੱਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰ ਵਜੋਂ ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਇਲਾਜ ਅਤੇ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਟੀਚਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਵਿਆਪਕ ਜੀਨੋਮਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਿੰਗ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਕੈਂਸਰ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਸੈਂਕੜੇ lncRNAs ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਕੰਮ ਜਿਆਦਾਤਰ ਅਣਜਾਣ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ56.ਕੈਂਸਰ ਦੀ ਪ੍ਰਗਤੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣਹਾਰ lncRNA ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ CRISPRi ਪ੍ਰਣਾਲੀ (ਚਿੱਤਰ 1a) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ SW620 ਕੋਲੋਰੈਕਟਲ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਫੈਲਣ ਲਈ ਇੱਕ ਨੁਕਸਾਨ-ਦਾ-ਫੰਕਸ਼ਨ ਸਕ੍ਰੀਨ ਕੀਤੀ।SW480 ਅਤੇ SW620 ਕੋਲਨ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਦੀ ਵਿਲੱਖਣ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਉਹ ਇੱਕ ਮਰੀਜ਼ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਟਿਊਮਰਾਂ ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਹਨ।ਇਹ ਉੱਨਤ ਕੋਲਨ ਕੈਂਸਰ ਦੀ ਤਰੱਕੀ ਵਿੱਚ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕੀਮਤੀ ਤੁਲਨਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ RNA ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੋਲੋਰੈਕਟਲ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ (SW480 ਅਤੇ SW620) ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਮ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਅਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਸਾਹਿਤ ਤੋਂ ਕੁਝ ਸੰਭਾਵੀ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ lncRNAs ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ।ਇਹਨਾਂ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪੂਲਡ sgRNA ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 7355 sgRNA oligos ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਜੋ 971 ਕੈਂਸਰ ਨਾਲ ਜੁੜੇ lncRNAs ਅਤੇ ਇੱਕ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਲਈ 500 ਗੈਰ-ਨਿਸ਼ਾਨਾ sgRNA oligos (ਪੂਰਕ ਡੇਟਾ 1) ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।
CRISPRi ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ।b ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ sgRNA ਸੰਸ਼ੋਧਨ।ਲੇਟਵੀਂ ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ ਲੌਗ2 (ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ) = ±0.58 ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਲੰਬਕਾਰੀ ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ p ਮੁੱਲ = 0.05 ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਕਾਲੇ ਬਿੰਦੀਆਂ ਗੈਰ-ਨਿਸ਼ਾਨਾ sgRNA (NC ਵਜੋਂ ਮਨੋਨੀਤ) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਲਾਲ ਬਿੰਦੀਆਂ DARS-AS1 ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ sgRNAs ਹਨ।ਨੀਲੇ ਬਿੰਦੀਆਂ LINC00205 ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ sgRNAs ਹਨ, ਇੱਕ ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਿਤ ਆਨਕੋਜੇਨਿਕ lncRNA।ਫੋਲਡ ਪਰਿਵਰਤਨ = (ਸਧਾਰਨ ਰੀਡਿੰਗ, ਦਿਨ 17)/(ਸਧਾਰਨ ਰੀਡਿੰਗ, ਦਿਨ 0)।c DARS-AS1 sgRNA ਨਾਕਡਾਊਨ ਸੈੱਲ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।ਗਲਤੀ ਬਾਰ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ± ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦਾ ਟੀ-ਟੈਸਟ।d ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ (TCGA ਡੇਟਾਸੈਟ)।BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ਅਤੇ COAD, ਕ੍ਰਮਵਾਰ (TCGA ਡੇਟਾਸੇਟ) ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਤੋਂ ਜੋੜੀਦਾਰ ਆਮ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ।ਪੇਅਰਡ ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ p-ਮੁੱਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਬਣਾਉਣ ਅਤੇ ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਸ ਨੂੰ ਪੈਕ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਚਾਰ ਸੁਤੰਤਰ ਸੰਕਰਮਣ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਉਪਰੋਕਤ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਨਾਲ dCas9-SW620 ਕੋਲੋਰੈਕਟਲ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤਾ।ਇਹਨਾਂ ਲਾਗਾਂ ਲਈ ਸੰਕਰਮਣ ਦੀ ਬਹੁਲਤਾ (MOI) 0.1–0.3 ਸੀ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਹਰੇਕ ਸੈੱਲ ਨੂੰ ਸਿਰਫ ਇੱਕ sgRNA ਨਾਲ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਕਲਚਰ ਦੇ 18 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, ਸਕਰੀਨਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਟੀਚਾ sgRNAs ਦਾ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਘਟਿਆ ਜਾਂ ਵਧਿਆ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਗੈਰ-ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਪ੍ਰੀ-ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਬਦਲੀ ਨਹੀਂ ਰਹੀ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਸਾਡੇ ਟੀਚੇ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਉੱਚ ਸਕਰੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਹੈ। ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ.ਚੌਲ.1ਬੀ ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1)। LINC00205, ਜੋ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਅਤੇ ਜਿਗਰ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ 58,59,60, ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਲੌਗ2 (ਫੋਲਡਚੇਂਜ) < −0.58, p ਮੁੱਲ <0.05), ਇਸ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੇ ਹੋਏ (ਚਿੱਤਰ 1b)। LINC00205, ਜੋ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਅਤੇ ਜਿਗਰ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ 58,59,60, ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਲੌਗ2 (ਫੋਲਡਚੇਂਜ) < −0.58, p ਮੁੱਲ <0.05), ਇਸ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੇ ਹੋਏ (ਚਿੱਤਰ 1b)। LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1ਬੀ). LINC00205, ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਅਤੇ ਜਿਗਰ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਦੀ ਤਰੱਕੀ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ 58,59,60, ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਲੌਗ 2 (ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ) <-0.58, ਪੀ-ਮੁੱਲ <0.05), ਇਸ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ. 1b) . ਲਿੰਕ 2505 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 和 肝癌 58,6,60, 被被 选 选 选 选 选 选 选 选 选 选 选 选 (ਲੌਗ 2 (倍数 倍数 变化) <-0.58, ਪੀ out <0.05), 证实 了 该 筛选 的 (图 1 ਬੀ). ਲਿੰਕ 2505 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 和 肝癌 58,6,60, 被被 选 选 选 选 选 选 选 选 选 选 选 选 (ਲੌਗ 2 (倍数 倍数 变化) <-0.58, ਪੀ out <0.05), 证实 了 该 筛选 的 (图 1 ਬੀ). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1ਬੀ). LINC00205, ਪਹਿਲਾਂ ਫੇਫੜਿਆਂ ਅਤੇ ਜਿਗਰ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਦੀ ਪ੍ਰਗਤੀ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ 58,59,60, ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਲੌਗ2 (ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ) <-0.58, p-ਮੁੱਲ <0.05), ਇਸ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ .1b)।
ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ lncRNAs ਵਿੱਚੋਂ, DARS-AS1 ਦੀ ਵੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 18 ਦਿਨਾਂ ਦੇ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤੀ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਤਿੰਨ ਕੋਗਨੇਟ sgRNA ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟੇ ਹਨ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਇਸ lncRNA ਦੇ ਨਾਕਡਾਊਨ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਫੈਲਣ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਆਈ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1b)।ਇਸ ਨਤੀਜੇ ਨੂੰ ਕੋਲੋਰੇਕਟਲ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MTS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਅੱਗੇ ਸਮਰਥਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਉਨ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਿਕਾਸ ਦਰ ਨਿਯੰਤਰਣ ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1c) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਅੱਧੀ ਰਹਿ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਕਈ ਹੋਰ ਕੈਂਸਰ ਕਿਸਮਾਂ ਦੀਆਂ ਪਿਛਲੀਆਂ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਸੀ।: ਸਪੱਸ਼ਟ ਸੈੱਲ ਕਿਡਨੀ ਕੈਂਸਰ, ਥਾਇਰਾਇਡ ਕੈਂਸਰ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਛੋਟੇ ਸੈੱਲ ਫੇਫੜਿਆਂ ਦਾ ਕੈਂਸਰ51,52,53,55।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੋਲੋਰੈਕਟਲ ਕੈਂਸਰ ਵਿੱਚ ਇਸਦਾ ਕਾਰਜ ਅਤੇ ਅਣੂ ਵਿਧੀ ਅਣਪਛਾਤੀ ਰਹਿੰਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਹੋਰ ਅਧਿਐਨ ਲਈ ਇਸ lncRNA ਨੂੰ ਚੁਣਿਆ ਹੈ।
ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਕੈਂਸਰ ਜੀਨੋਮ ਐਟਲਸ (TCGA) ਪ੍ਰੋਜੈਕਟ ਤੋਂ 10,327 ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਆਪਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ।ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਵੱਖ-ਵੱਖ ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਹਤਮੰਦ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਕੋਲੋਨ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (COAD), ਰੇਨਲ ਕਲੀਅਰ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸਿਨੋਮਾ (KIRC), ਅਤੇ ਰੇਨਲ ਪੈਪਿਲਰੀ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸਿਨੋਮਾ (KIRP) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।.ਬਹੁਤ ਘੱਟ (Fig. 1d ਅਤੇ ਪੂਰਕ Fig. 1a, b)। ਜੋੜੀਦਾਰ ਸਿਹਤਮੰਦ/ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਬਲੈਡਰ ਯੂਰੋਥੈਲਿਅਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (BLCA), ਗੁਰਦੇ ਦੇ ਰੇਨਲ ਕਲੀਅਰ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (KIRC), ਪ੍ਰੋਸਟੇਟ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (PRAD), ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਸਕਵਾਮਸ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUSC) ਦੇ ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਦੇ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ। , ਗਰੱਭਾਸ਼ਯ ਕਾਰਪਸ ਐਂਡੋਮੈਟਰੀਅਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (UCEC), ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUAD), ਜਿਗਰ ਹੈਪੇਟੋਸੈਲੂਲਰ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LIHC), ਗੁਰਦੇ ਦੇ ਰੇਨਲ ਪੈਪਿਲਰੀ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (KIRP), ਅਤੇ ਕੋਲਨ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (COAD) (ਪੀ ਮੁੱਲ <0.05) (ਚਿੱਤਰ 1e) . ਜੋੜੀਦਾਰ ਸਿਹਤਮੰਦ/ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਬਲੈਡਰ ਯੂਰੋਥੈਲਿਅਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (BLCA), ਗੁਰਦੇ ਦੇ ਰੇਨਲ ਕਲੀਅਰ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (KIRC), ਪ੍ਰੋਸਟੇਟ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (PRAD), ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਸਕਵਾਮਸ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUSC) ਦੇ ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਦੇ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ। , ਗਰੱਭਾਸ਼ਯ ਕਾਰਪਸ ਐਂਡੋਮੈਟਰੀਅਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (UCEC), ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUAD), ਜਿਗਰ ਹੈਪੇਟੋਸੈਲੂਲਰ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LIHC), ਗੁਰਦੇ ਦੇ ਰੇਨਲ ਪੈਪਿਲਰੀ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (KIRP), ਅਤੇ ਕੋਲਨ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (COAD) (ਪੀ ਮੁੱਲ <0.05) (ਚਿੱਤਰ 1e) .ਪੇਅਰ ਕੀਤੇ ਸਿਹਤਮੰਦ/ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਬਲੈਡਰ ਯੂਰੋਥੈਲਿਅਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (BLCA), ਕਲੀਅਰ ਸੈੱਲ ਰੇਨਲ ਅਤੇ ਰੇਨਲ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (KIRC), ਪ੍ਰੋਸਟੇਟ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (PRAD), ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਸਕੁਆਮਸ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUSC) ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਦੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ।, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– ਮੀ)। , corpus uteri (UCEC) ਦਾ ਐਂਡੋਮੈਟਰੀਅਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ, ਫੇਫੜਿਆਂ ਦਾ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUAD), ਜਿਗਰ ਦਾ ਹੈਪੇਟੋਸੈਲੂਲਰ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LIHC), ਗੁਰਦੇ ਦਾ ਪੈਪਿਲਰੀ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸਿਨੋਮਾ (KIRP), ਅਤੇ ਕੋਲਨ (COAD) ਦਾ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (ਪੀ ਮੁੱਲ < 0.05) (ਚਿੱਤਰ 1e–m)।. . <0.05）（图1e-m） .. .癌 (ਕਿਰਪ) （ਕੋਡ） (ਪੀ 值<0.05）） (图1e-m）)।ਸਿਹਤਮੰਦ/ਟਿਊਮਰ ਪੇਅਰਡ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਬਲੈਡਰ ਯੂਰੋਥੈਲਿਅਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (ਬੀਐਲਸੀਏ), ਕਲੀਅਰ ਸੈੱਲ ਰੇਨਲ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (ਕੇਆਈਆਰਸੀ), ਪ੍ਰੋਸਟੇਟ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (ਪੀਆਰਏਡੀ), ਅਤੇ ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਸਕੁਆਮਸ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUSC) ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕੀਤਾ।экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ਕਾਰਪਸ ਗਰੱਭਾਸ਼ਯ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (UCEC), ਫੇਫੜਿਆਂ ਦੇ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LUAD), ਹੈਪੇਟੋਸੈਲੂਲਰ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (LIHC), ਰੇਨਲ ਪੈਪਿਲਰੀ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (KIRP), ਅਤੇ ਕੋਲਨ ਐਡੀਨੋਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (COAD) (ਪੀ ਮੁੱਲ <0.05) (ਚਿੱਤਰ 1e -m) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਕਈ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
ਕਿਉਂਕਿ DARS-AS1 ਅਤੇ DARS (ਐਂਟੀਸੈਂਸ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਨੂੰ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਜੀਨ) ਇੱਕੋ ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਦੇ ਨੇੜੇ ਸਥਿਤ ਹਨ, ਅਸੀਂ shRNA ਨੂੰ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ DARS-AS1 ਨੂੰ ਨਾਕਡਾਊਨ ਕਰਨ ਲਈ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤਾ ਹੈ ਪਰ DARS (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2a,b ਅਤੇ ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਟੇਬਲ 2) ਨਹੀਂ। .SW620 ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ shRNA ਨਾਕਡਾਊਨ (ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਟੇਬਲ 3) ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ ਕਾਰਜ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ DARS-AS1 ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਤਿੰਨ ਹੋਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਵੀ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਸਾਰੇ ਤਿੰਨ shRNAs ਨੇ DARS mRNA (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2c–f) ਦੀ ਮਾਤਰਾ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇ ਨਾਲ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 80% DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਊਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਇਹਨਾਂ shRNAs ਨਾਲ DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਊਨ ਨੇ ਕੋਲੋਰੇਕਟਲ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ SW620 (49.7%) ਅਤੇ HCT116 (27.7%), ਛਾਤੀ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ MBA-MD-231 (53.4%) ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰੋਕਿਆ ਹੈ।) ਅਤੇ HepG2 ਹੈਪੇਟੋਮਾ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ (92.7% ਕਟੌਤੀ), ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਗੈਰ-ਏਂਕਰਡ ਗੋਲੇ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ (~50.8%, 44.6%, 40.7% ਅਤੇ 75.7% ਪ੍ਰਤੀ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਦੀ ਔਸਤ ਕਮੀ) (ਚਿੱਤਰ 2a,b)।SW620 ਵਿੱਚ, ਕਲੋਨੀ ਨਿਰਮਾਣ ਪਰਖ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਅੱਗੇ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ DARS-AS1 shRNA ਨੇ ਲਗਭਗ 69.6% (ਚਿੱਤਰ 2c) ਦੀ ਔਸਤਨ ਕਮੀ ਦੇ ਨਾਲ ਸੈੱਲ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਰੋਕਿਆ।
SW620, HCT116, MBA-MD-231, ਅਤੇ HepG2 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ (a) ਅਤੇ ਗੋਲਾਕਾਰ ਗਠਨ (b) 'ਤੇ ਨਿਯੰਤਰਣ shRNA ਅਤੇ DARS-AS1 shRNA ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ।c ਨਿਯੰਤਰਣ shRNA ਅਤੇ DARS-AS1 shRNA ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕਾਲੋਨੀ ਗਠਨ 'ਤੇ।ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ (d), ਗੋਲਾਕਾਰ ਗਠਨ (e), ਅਤੇ DARS-AS1 ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਕਲੋਨੀ ਬਣਤਰ (f)।ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਡੇਟਾ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦਾ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਹੈ।* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ਅਤੇ *** p ≤ 0.001 ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੁਆਰਾ।
ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਦੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਅਗਲੀ ਵਾਰ DARS-AS1 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2g) ਨੂੰ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ SW620 ਸੈੱਲ ਬਣਾਏ।DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਨੇ SW620 ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ 2d–f) ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਵਾਧੇ (1.8-ਗੁਣਾ), ਅਣ-ਐਂਕੋਰਡ ਗੋਲਾਕਾਰ ਗਠਨ (1.4-ਗੁਣਾ), ਅਤੇ ਕਲੋਨੀ ਗਠਨ (3.3-ਗੁਣਾ) ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਹੋਰ DARS-AS1 ਐਕਸਪ੍ਰੈਸਿੰਗ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ, A549 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਸ ਨਤੀਜੇ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ।DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਦੇ ਕਾਰਨ ਇਹ ਵਧਿਆ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਅੱਗੇ A549 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2h, i ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 3)।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਲਾਭ ਅਤੇ ਨੁਕਸਾਨ ਅਧਿਐਨ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਅੰਡਰਲਾਈੰਗ ਵਿਧੀ ਦੀ ਪੜਚੋਲ ਕਰਨ ਲਈ ਜਿਸ ਦੁਆਰਾ DARS-AS1 ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਇਸਦੇ ਸੰਭਾਵੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ RNA ਪੁੱਲ-ਡਾਊਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ।RT-qPCR ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਦਾ ਲਗਭਗ 86.2% SW620 ਸੈੱਲਾਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3a) ਦੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹੈ।ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਾਈਬਡ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ DARS-AS1 ਜਾਂ pseudoRNA ਨੂੰ ਫਿਰ SW620 ਸੈੱਲ ਲਾਈਸੇਟਸ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ SDS-PAGE ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਬਾਅਦ ਦੇ ਚਾਂਦੀ ਦੇ ਧੱਬੇ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਪੁੱਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵੱਖਰਾ ਬੈਂਡ (~38 kDa) ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਸੀ ਪਰ ਡਮੀ RNA ਜਾਂ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ (ਚਿੱਤਰ 3a) ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ।ਇਸ ਬੈਂਡ ਨੂੰ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (MS) ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ PKR ਐਕਟੀਵੇਟਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (PACT) ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਅੱਗੇ SW620, HCT116, ਅਤੇ HepG2 ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3a,b) ਵਿੱਚ ਇਮਯੂਨੋਬਲੋਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।DARS ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ PACT ਪ੍ਰੋਟੀਨ - PKR ਅਤੇ TRBP - ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦੀ ਵੀ ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ (WB) ਦੁਆਰਾ RNA ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ DARS-AS1 RNA ਅਤੇ ਇਹਨਾਂ ਤਿੰਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਕੋਈ ਸਿੱਧਾ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਪਾਇਆ ਗਿਆ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3b)।DARS-AS1 ਅਤੇ PACT ਵਿਚਕਾਰ ਖਾਸ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਹੋਰ ਅੱਗੇ RNA ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ (RIP) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਐਂਟੀ-ਪੈਕਟ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਸੀ ਪਰ ਹੋਰ ਨਿਯੰਤਰਣ RNAs (ਚਿੱਤਰ 3c) ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ।ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ DARS-AS1 ਕਿਸੇ ਹੋਰ ਸੈਲੂਲਰ ਭਾਗਾਂ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ PACT ਨਾਲ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਬਾਇਓਲੇਅਰ ਇੰਟਰਫੇਰੋਮੈਟਰੀ (BLI) ਪਰਖ ਸ਼ੁੱਧ PACT ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਬਾਇਓਟਿਨ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ DARS-AS1 ਜਾਂ ਡਮੀ RNA ਨੂੰ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ (SA) ਬਾਇਓਸੈਂਸਰਾਂ 'ਤੇ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ 1 μM PACT ਵਾਲੇ ਕਾਇਨੇਟਿਕ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, PACT DARS-AS1 (KD ਮੁੱਲ ~26.9 nM) ਨਾਲ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਪਰ RNA (ਚਿੱਤਰ 3d) ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਨ ਲਈ ਨਹੀਂ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ DARS-AS1 ਅਤੇ PACT ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਿੱਧੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਅਤੇ ਉੱਚ ਸਾਂਝ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।
RNA ਪੁੱਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ PACT ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ DARS-AS1 ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ।ਉੱਪਰ, ਸੰਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਚਾਂਦੀ ਦੇ ਧੱਬੇ.ਹੇਠਲੇ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟਸ ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।b RNA ਪੁੱਲ-ਡਾਊਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ HCT116 (ਚੋਟੀ) ਅਤੇ HepG2 (ਹੇਠਲੇ) ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।PACT ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਇਮਯੂਨੋਬਲੋਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ.CRNA ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ (RIP) ਅਸੈਸ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਕੇਤ ਕੀਤੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।d ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ DARS-AS1 ਜਾਂ ਕੰਟਰੋਲ RNA ਲਈ PACT ਬਾਈਡਿੰਗ ਕਰਵ ਬਾਇਓਲੇਅਰ ਇੰਟਰਫੇਰੋਮੈਟਰੀ (BLI) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਬਾਇਓਸੈਂਸਰ 'ਤੇ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।1 μM PACT ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ.e RNA ਪੁੱਲ ਪਰਖ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ DARS-AS1 ਜਾਂ ਕੱਟੇ ਹੋਏ (ਟੌਪ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟ ਪੀਏਸੀਟੀ ਪ੍ਰਾਪਤ (ਹੇਠਾਂ) ਦਿਖਾ ਰਿਹਾ ਹੈ।f ਸ਼ੁੱਧ ਫਲੈਗਡ PACT ਨੂੰ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ DARS-AS1 ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਾਂ ਇਨ ਵਿਟਰੋ RIP ਪਰਖ ਲਈ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਈ)।ਕੱਢੇ ਗਏ RNA ਦੀ RT-qPCR ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।g PACT ਲਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ RNA ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰੀ ਬਾਇਓਲੇਅਰ ਇੰਟਰਫੇਰੋਮੈਟਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, 100 nM RNA ਅਤੇ 1 μM RAST ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।h ਇਨ ਵਿਟਰੋ RIP ਅਸੇਸ ਸ਼ੁੱਧ ਬਰਕਰਾਰ ਜਾਂ ਕੱਟੇ ਹੋਏ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ PACT ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਕੱਢੇ ਗਏ RNA ਦੀ RT-qPCR ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।i DARS-AS1, PACT, ਜਾਂ ਦੋਵਾਂ ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਿਕਾਸ ਦਰ।j SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਜਾਂ ਕੱਟੇ ਹੋਏ DARS-AS1 ਦੇ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸਨ।k ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ ਦਾ ਪਤਾ ਐਂਟੀ-PARP ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਇਮਯੂਨੋਬਲੋਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।l DARS-AS1 ਦਾ ਨਾਕਆਊਟ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪ੍ਰਵਾਹ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਡੇਟਾ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦਾ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਹੈ। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ ਟੈਸਟ ਦੁਆਰਾ। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ ਟੈਸਟ ਦੁਆਰਾ। *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੁਆਰਾ। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੁਆਰਾ।
ਅਸੀਂ ਫਿਰ PACT ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 3e) ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ DARS-AS1 ਖੇਤਰ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਤਿੰਨ ਬਾਇਓਟਿਨੀਲੇਟਿਡ DARS-AS1 RNA ਟੁਕੜੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ।RNA ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਹਰ ਇੱਕ ਟੁਕੜਾ PACT ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ, ਪਰ 3′-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ (384–768 ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ A3) ਨੇ 1–384 ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ A1) (ਚਿੱਤਰ 3e) ਤੋਂ ਵੱਧ ਦਿਖਾਇਆ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ PACT (ਚਿੱਤਰ 3f) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇਨ ਵਿਟਰੋ RIP ਪਰਖ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਹਨਾਂ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, BLI ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ PACT ਨਾਲ ਸਥਿਰ RNA ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੇ ਇਹ ਵੀ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ PACT ਦਾ A3 (384–768 nt) (ਲਗਭਗ 94.6 nM ਦਾ KD ਮੁੱਲ) ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਸਬੰਧ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਦੂਜੇ ਖੇਤਰਾਂ ਨਾਲ ਲਗਭਗ ਕੋਈ ਸਬੰਧ ਨਹੀਂ ਹੈ।(ਚਿੱਤਰ 3 ਡੀ).
ਅਸੀਂ PACT ਵਿੱਚ ਸਬੰਧਿਤ ਬਾਈਡਿੰਗ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਵੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।PACT ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਡੋਮੇਨ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਦੋ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ RNA-ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ (dsRBD) ਅਤੇ ਇੱਕ ਤੀਜਾ ਡੋਮੇਨ (ਨਿਯੁਕਤ D3) ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਨ ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਐਕਟੀਵੇਟਰ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਹਰੇਕ ਡੋਮੇਨ ਦੀ lncRNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਮਰੱਥਾ ਦਾ ਮੁਆਇਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਤਿੰਨ ਪਰਿਵਰਤਨ ਇੰਜਨੀਅਰ ਕੀਤੇ ਹਨ ਜੋ ਤਿੰਨਾਂ ਡੋਮੇਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਹਰੇਕ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਇਨ ਵਿਟਰੋ RIP ਅਸੇਅ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਸਾਡੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ PACT ਦੇ ਤੀਜੇ ਡੋਮੇਨ (D3) ਨੂੰ ਮਿਟਾਉਣ ਨਾਲ ਦੂਜੇ ਦੋ ਮਿਊਟੇਸ਼ਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3h) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ DARS-AS1 (ਅੰਤਰਿਤ ਪੀਏਸੀਟੀ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ 0.11-ਗੁਣਾ ਦੁਆਰਾ) ਦੇ ਨਾਲ ਇਸਦੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਹ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਕਿ ਰੀਲੀਜ਼. ਦੇ D3 ਨੇ DARS ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਕੀਤੀ।-AC1.ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਅਤੇ PACT ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ DARS-AS1 ਦੇ 3′ ਅੰਤ ਅਤੇ PACT ਦੇ D3 ਡੋਮੇਨ ਦੁਆਰਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 ਦਾ PACT ਸਮੀਕਰਨ 'ਤੇ ਕੋਈ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਸੀ ਅਤੇ PACT ਦਾ DARS-AS1 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3c) 'ਤੇ ਕੋਈ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਸੀ।ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਸੈੱਲ ਦੇ ਵਾਧੇ 'ਤੇ PACT ਨਾਕਡਾਊਨ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।DARS-AS1 ਦੇ ਉਲਟ, ਜਦੋਂ PACT ਨੂੰ ਖੜਕਾਇਆ ਗਿਆ ਤਾਂ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਸੈੱਲ 1.5-3 ਗੁਣਾ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਵਧੇ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3d)।ਕਲੋਨੀ ਨਿਰਮਾਣ ਪਰਖ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਪੀਏਸੀਟੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3e) ਨਾਲ shRNA ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 2-3-ਗੁਣਾ ਕਾਲੋਨੀਆਂ ਬਣਾਈਆਂ।ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ DARS-AS1 PACT ਦੁਆਰਾ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ PACT, DARS-AS1, ਜਾਂ ਦੋਵਾਂ ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ SW620 ਸੈੱਲ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਹਨ।ਪੀਏਸੀਟੀ ਦੇ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਨੇ ਸੈੱਲ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ (ਚਿੱਤਰ 3i) ਦੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਰੁਕਾਵਟ ਨੂੰ ਦਿਖਾਇਆ।ਜਦੋਂ ਕਿ DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਪ੍ਰਤੀ se ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, DARS-AS1 ਅਤੇ PACT ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਿਕਾਸ ਦਰ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਸੀ।ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ PACT DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੇਸ਼ਨ ਦੇ ਕਾਰਨ ਵਧੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਸਾਰ ਦਾ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਕਿਉਂਕਿ DARS-AS1 ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ PACT-ਬਾਈਡਿੰਗ ਯੋਗਤਾਵਾਂ ਹਨ, ਅਸੀਂ DARS-AS1 ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ 'ਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਦੂਜੇ ਦੋ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, DARS-AS1 ਨੂੰ 3′ ਸਿਰੇ (384–768 nt), DARS-AS1 ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ PACT-ਸਬੰਧਤ ਖੇਤਰ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ (ਚਿੱਤਰ 3j) ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਨ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਮਰੱਥਾ ਸੀ, ਉੱਤੇ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹ ਨਤੀਜੇ DARS-AS1 ਦੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਮਰੱਥਾ ਅਤੇ ਜੈਵਿਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
PACT ਨੂੰ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋ-ਐਪੋਪੋਟਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 19 ਹੋਣ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ 'ਤੇ DARS-AS1 ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ.ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਊਨ ਨੇ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ PARP ਕਲੀਵੇਜ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧਾਇਆ ਅਤੇ SW620, HCT116, HepG2, ਅਤੇ MBA-MD-231 ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3k) ਵਿੱਚ ਐਨੈਕਸੀਨ V- ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਕੀਤਾ।3).3f–h), ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਦਾ ਐਂਟੀ-ਐਪੋਪੋਟੋਟਿਕ ਪ੍ਰਭਾਵ PACT ਦੇ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ-ਇੰਡਿਊਸਿੰਗ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੇ ਉਲਟ ਹੈ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਆਨਕੋਜੇਨਿਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੀ ਵਿਧੀ PACT ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੇ ਰੋਕ ਦੁਆਰਾ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ DARS-AS1-PACT ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਦੇ ਕਾਰਜਾਤਮਕ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੀ ਪੜਚੋਲ ਕੀਤੀ।PACT ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੁਆਰਾ PKR ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ eIF2α ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਅਨੁਵਾਦਕ ਮਿਟਾਉਣਾ ਅਤੇ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ 17 ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਪਹਿਲਾਂ, ਅਸੀਂ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਕਿ ਕੀ DARS-AS1 PACT ਅਤੇ PKR ਦੇ ਸੈਲੂਲਰ ਸਥਾਨਕਕਰਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਕਨਫੋਕਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ PACT ਅਤੇ PKR ਨੂੰ 0.72 ਦੇ ਔਸਤ ਪੀਅਰਸਨ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧ ਗੁਣਾਂਕ ਦੇ ਨਾਲ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੰਚਾਲਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਸ ਦੌਰਾਨ, DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਨੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ PACT ਅਤੇ PKR ਸਹਿ-ਸਥਾਨੀਕਰਨ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ (ਮਤਲਬ ਪੀਅਰਸਨ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧ ਗੁਣਾਂਕ 0.61) (ਚਿੱਤਰ 4a)।ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ DARS-AS1 PACT-PKR ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਸੰਚਾਲਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ SW620 ਸੈੱਲ ਲਾਈਸੈਟਸ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਹਿ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ (ਕੋ-ਆਈਪੀ) ਪਰਖ ਕੀਤੀ।ਪੀਕੇਆਰ ਨੂੰ ਕੰਟਰੋਲ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਪੀਕੇਆਰ ਰਿਕਵਰੀ DARS-AS1 (ਚਿੱਤਰ 4b) ਨੂੰ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਲਾਈਸੇਟਸ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸ਼ੁੱਧ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ PACT ਅਤੇ PKR ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਸੈਸ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਸ ਅਨੁਸਾਰ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੇ DARS-AS1 ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਪਰ ਕੋਈ ਨਿਯੰਤਰਣ RNA ਨੇ ਦਬਾਇਆ PACT-PKR ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਿਖਾਇਆ (ਚਿੱਤਰ 4c)।ਸਾਰੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਨੇ PACT ਅਤੇ PKR ਸੰਚਾਰ ਵਿੱਚ ਵਿਘਨ ਪਾਇਆ।
ਕੰਟਰੋਲ ਸੈੱਲਾਂ ਜਾਂ DARS-AS1 ਨੂੰ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ PACT ਅਤੇ PKR ਦਾ ਸਹਿ-ਸਥਾਨਕੀਕਰਨ ਕਨਫੋਕਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਿਊਕਲੀਅਸ DAPI ਨਾਲ ਰੰਗੇ ਹੋਏ ਸਨ।ਅੰਕੜਿਆਂ ਦੇ ਨਤੀਜੇ 16 ਤਸਵੀਰਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।b ਕੋ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ (ਕੋ-ਆਈਪੀ) ਨਿਯੰਤਰਣ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਸੈੱਲ ਲਾਈਸੈਟਸ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜਾਂ DARS-AS1 ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲ।c ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ PACT, ਸ਼ੁੱਧ PKR ਅਤੇ DARS-AS1 ਜਾਂ ਮੌਕ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਵਿਟਰੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਐਂਟੀ-ਫਲੈਗ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।d ਸੰਕੇਤ ਕੀਤੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਵਾਲੇ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟਸ ਨੂੰ SW620 ਅਤੇ HCT116 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕੰਟਰੋਲ shRNA ਜਾਂ DARS-AS1-shRNA ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੀਰਮ ਭੁੱਖਮਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।e DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰਾਂ ਨੇ ਥੈਪਸੀਗਾਰਗਿਨ ਲਈ ਸੈਲੂਲਰ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ।SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੇਸ਼ਨ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਜਾਂ ਕੰਟਰੋਲ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਨਾਲ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਥੈਪਸੀਗਾਰਜਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਐਮਟੀਐਸ ਰੀਐਜੈਂਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੈੱਲ ਦੀ ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।f ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ DARS-AS1 ਜਾਂ ਡਮੀ RNA ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ PACT ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਅਸੇ ਅਤੇ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟ ਖੋਜ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।g ਇਹਨਾਂ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟਸ SW620-ctrl ਸੈੱਲਾਂ (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ PKR ਮਿਊਟੈਂਟਸ (ਸੱਜੇ) ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਹ ਸੈੱਲ ਫਿਰ ਸੀਰਮ ਭੁੱਖਮਰੀ ਦੇ ਬਾਅਦ ਕੰਟਰੋਲ shRNA ਜਾਂ DARS-AS1-shRNA ਨਾਲ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।h ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ PKR ਦੀ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਨੇ SW620 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ ਲਈ ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਦਿੱਤਾ।i ਸੰਕੇਤਕ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਵਾਲੇ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟਸ SW620 (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ HCT116 (ਸੱਜੇ) ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਕੰਟਰੋਲ shRNA ਜਾਂ DARS-AS1 shRNA ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਟ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲ ਸੀਰਮ ਤੋਂ ਵਾਂਝੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ 100 nM PKR C16 ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਜਾਂ DMSO ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਸਕੇਲ ਬਾਰ = 5 µm।ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਡੇਟਾ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦਾ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਹੈ।* p ≤ 0.05 ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦਾ ਟੀ-ਟੈਸਟ।
ਇਹ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇੱਕ ਵਾਰ PACT PKR17 ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, Thr451 'ਤੇ PKR ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਪੀਕੇਆਰ ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਦਾ ਪੱਧਰ ਸੀਰਮ ਭੁੱਖਮਰੀ (ਚਿੱਤਰ 4d ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4a) ਤੋਂ ਬਾਅਦ DARS-AS1 ਨਾਕਡਾਊਨ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚਾ ਹੋਇਆ ਸੀ।ਇਸ ਅਨੁਸਾਰ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ eIF2α ਦਾ ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ, ਮੁੱਖ PKR ਸਬਸਟਰੇਟ, DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d ਅਤੇ ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ Fig. 4a) ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਥੈਪਸੀਗਾਰਗਿਨ ਇੱਕ ER ਤਣਾਅ ਹੈ ਜੋ ER ਨੂੰ Ca2+ ਛੱਡਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦਾ ਹੈ।ਥੈਪਸੀਗਾਰਜਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ PACT ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਅਤੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਅੱਗੇ PKR ਨਾਲ ਸੰਪਰਕ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸਰਗਰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ eIF2α ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ 18,61 ਨੂੰ ਵਧਾ ਕੇ ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ DARS-AS1 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ PACT/PKR ਮਾਰਗ ਨੂੰ ਰੋਕ ਕੇ ਤਣਾਅ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ PACT/PKR ਮਾਰਗ ਦੇ ਇੱਕ ਉਤੇਜਕ ਵਜੋਂ ਥੈਪਸੀਗਾਰਗਿਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਦਾ ਪੱਧਰ ਥੈਪਸੀਗਾਰਜਿਨ ਦੇ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਨਾਲ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਬੰਧ ਰੱਖਦਾ ਹੈ।DARS-AS1 ਨੂੰ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ SW620 ਸੈੱਲ ਜਦੋਂ ਥੈਪਸੀਗਾਰਗਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਤਾਂ ਬਿਹਤਰ ਬਚੇ, ਜਦੋਂ ਕਿ DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਊਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲ ਵਧੇਰੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਬਣ ਗਏ (ਚਿੱਤਰ 4e)।ਇਹਨਾਂ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਨੇ ਥੈਪਸੀਗਾਰਜਿਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ PKR ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4b) ਨੂੰ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ।ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, ਥੈਪਸੀਗਰਗਿਨ ਦੇ ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪੀਕੇਆਰ ਅਤੇ ਈਆਈਐਫ2α ਨੂੰ ਕੰਟਰੋਲ ਸੈੱਲਾਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4b) ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਊਨ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਉੱਚ ਹੱਦ ਤੱਕ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਥੈਪਸੀਗਰਗਿਨ ਨੇ ਖੁਰਾਕ-ਨਿਰਭਰ ਢੰਗ ਨਾਲ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਕਿ DARS-AS1 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4c) ਦੇ ਇੱਕ ਤਣਾਅ-ਵਿਰੋਧੀ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਟਰੋ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਅਸੈਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਪੀਕੇਆਰ ਨੂੰ ਇੱਕ ਐਂਟੀ-ਪੀਕੇਆਰ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੈੱਲ ਲਾਈਸੈਟਸ ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਡ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ PACT ਅਤੇ DARS-AS1 ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਐਂਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਡਬਲਯੂਬੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਫਾਸਫੋ-ਪੀਕੇਆਰ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ.ਸਾਡੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਪੀਕੇਆਰ ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ DARS-AS1 ਦੁਆਰਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰੋਕਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਰ ਕੰਟਰੋਲ ਆਰਐਨਏ ਦੁਆਰਾ ਨਹੀਂ (ਚਿੱਤਰ 4f)।ਇਹ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਵੋ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 PACT-ਵਿਚੋਲੇ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।ਉਸੇ ਸਮੇਂ, ਅਸੀਂ DARS-AS1 (ਚਿੱਤਰ 4f) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ PACT ਰਿਕਵਰੀ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਵੀ ਵੇਖੀ ਹੈ।ਇਹ ਨਤੀਜਾ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਸੈਸ (ਚਿੱਤਰ 4c) ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ ਅਤੇ ਦੁਬਾਰਾ PACT-PKR ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਲਈ DARS-AS1 ਦੇ ਬਲਾਕਿੰਗ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
PACT ਦੇ D3 ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ Ser246 ਅਤੇ Ser287 ਸੈਲੂਲਰ ਤਣਾਅ ਦੇ ਅਧੀਨ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਹਨ।ਅਲਾਨਾਈਨ ਲਈ ਦੋ ਸੀਰੀਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਬਦਲ ਨੇ ਮਿਊਟੈਂਟ PACT (mutD) ਦਿੱਤਾ, ਜਿਸ ਨੇ ਤਣਾਅ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ PKR ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਅਲਾਨਾਈਨ (mutA) ਦੇ ਬਦਲ ਨੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਦਿੱਤਾ।ਕਿਉਂਕਿ ਅਸੀਂ DARS-AS1 ਨਾਲ ਸਿੱਧੇ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ ਇਸ ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਟੈਸਟ ਕਰਨ ਲਈ ਇਹ ਦੋ PACT ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਹਨ ਕਿ ਕੀ ਇਹ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਵੀ DARS-AS1 ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਦੋਵੇਂ ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਨੇ DARS-AS1 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4d) ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਗੁਆ ਦਿੱਤੀ ਹੈ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 ਨਾਲ ਕੁਸ਼ਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਲਈ PACT ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪੂਰੀ ਬਣਤਰ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਇਹ ਵੀ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1-shRNA-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ ਦੀ ਰੋਕਥਾਮ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਨਕਾਰਾਤਮਕ PACT ਮਿਊਟੈਂਟ (PACTmutA) ਜਾਂ ਇੱਕ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਨਕਾਰਾਤਮਕ PKR ਮਿਊਟੈਂਟ (PKRmut) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4e. e) ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਕੇ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਹਾਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰਭਾਵੀ-ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਪੀਕੇਆਰ ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਦੀ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਨੇ DARS-AS1 ਨਾਕਡਾਊਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ PKR ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਸੀਰਮ-ਵੰਚਿਤ ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4g) ਵਿੱਚ eIF2α ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਘਟਾਇਆ।ਵਧੇਰੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਉਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਐਪੋਪਟੋਟਿਕ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ ਵੀ ਪੀਕੇਆਰਮਟ (ਚਿੱਤਰ 4h ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4g) ਨੂੰ ਓਵਰਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।PKR kinase ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ ਰੋਕਥਾਮ DARS-AS1 ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵੀ ਕਮਜ਼ੋਰ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 ਨਾਕਡਾਊਨ ਨੇ PKR ਅਤੇ eIF2α ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਘੱਟ ਹੀ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ PKR-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ C16 ਇਨਿਹਿਬਟਰ (ਚਿੱਤਰ 4i ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4) ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।).ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਸੈੱਲ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਹਿੱਸੇ ਵਿੱਚ, PACT-ਵਿਚੋਲੇ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕ ਕੇ.
ਟਿਊਮੋਰੀਜੇਨੇਸਿਸ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਦੀ ਹੋਰ ਪੜਚੋਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਮਾਊਸ xenograft ਮਾਡਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵੀਵੋ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ। ਨਤੀਜੇ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਦੇ ਨੋਕਡਾਊਨ ਨੇ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਵਿੱਚ ਨਾਟਕੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਮੀ ਕੀਤੀ ਹੈ (ਪੀ ਮੁੱਲ <0.0001) (ਚਿੱਤਰ 5a)। ਨਤੀਜੇ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਦੇ ਨੋਕਡਾਊਨ ਨੇ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਵਿੱਚ ਨਾਟਕੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਮੀ ਕੀਤੀ ਹੈ (ਪੀ ਮੁੱਲ <0.0001) (ਚਿੱਤਰ 5a)। Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਨਾਕਡਾਊਨ ਚੂਹਿਆਂ (ਪੀ ਮੁੱਲ <0.0001) (ਚਿੱਤਰ 5a) ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（图5a）।结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）। Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਨਾਕਡਾਊਨ ਨੇ ਚੂਹਿਆਂ (ਪੀ ਮੁੱਲ <0.0001) (ਚਿੱਤਰ 5a) ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, DARS-AS1 ਨਾਕਡਾਊਨ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ, ਔਸਤ ਟਿਊਮਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ 72.9% ਅਤੇ ਮਤਲਬ ਟਿਊਮਰ ਪੁੰਜ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ 87.8% (ਚਿੱਤਰ 5b-d) ਦੀ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਸੀ।ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 Vivo ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਨਗਨ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਕੋਲੋਰੈਕਟਲ ਓਨਕੋਜੀਨੇਸਿਸ 'ਤੇ DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਊਨ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ।ਵਿਕਾਸ ਵਕਰ (a), ਟਿਊਮਰ ਦਾ ਆਕਾਰ (b), ਭਾਰ (c), ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਚਿੱਤਰ (d) ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।ਗਲਤੀ ਪੱਟੀ ± SEM ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। n = 10. ****p <0.0001, ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ ਟੈਸਟ ਦੁਆਰਾ। n = 10. ****p <0.0001, ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ ਟੈਸਟ ਦੁਆਰਾ। n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦਾ ਟੀ-ਟੈਸਟ।n = 10। ****ਪੀ <0.0001, 通过双尾学生t 检验। ****ਪੀ <0.0001, 通过双尾学生t检验। ****ਪੀ < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦਾ ਟੀ-ਟੈਸਟ।e Kaplan-Meier ਨੇ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰਾਂ ਅਤੇ UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ਅਤੇ LGG ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਸਮੁੱਚੇ ਬਚਾਅ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ।ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰ ਚੋਟੀ ਦੇ 50% ਵਿੱਚ ਸਨ;ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਦਾ ਨੀਵਾਂ ਪੱਧਰ ਹੇਠਾਂ 50% ਵਿੱਚ ਸੀ।p-ਮੁੱਲ ਲੌਗ ਰੈਂਕ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।f ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਮਾਡਲ ਜਿਸ ਵਿੱਚ DARS-AS1 PACT-PKR ਮਾਰਗ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।
DARS-AS1 ਦੇ ਕਲੀਨਿਕਲ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸਮਝਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇਸਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਅਤੇ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਬਚਾਅ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।TCGA ਡੇਟਾਸੈਟ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਕੇ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਉੱਚ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਯੂਵੀਲ ਮੇਲਾਨੋਮਾ (UVM), ਰੇਨਲ ਕ੍ਰੋਮੋਫੋਬੀਆ (KICH), ਰੇਨਲ ਪੈਪਿਲਰੀ ਸੈੱਲ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (KIRP), ਮੇਸੋਥੈਲੀਓਮਾ (MESO), ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ।ਹੇਠਲੇ ਬਚਾਅ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗਲਾਈਓਬਲਾਸਟੋਮਾ ਮੋਰਫੋਸਿਸ (GBM) ਅਤੇ ਘੱਟ ਦਰਜੇ ਦੇ ਬ੍ਰੇਨ ਗਲੀਓਮਾ (LGG) (ਚਿੱਤਰ 5e) ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 ਕਲੀਨਿਕਲ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਕਈ ਕੈਂਸਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਬਾਇਓਮਾਰਕਰ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਵੱਡੇ ਪੈਮਾਨੇ ਦੀ CRISPRi ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਿਤ ਕੀਤਾ ਕਿ DARS-AS1 lncRNA ਦੋ ਮੁੱਖ ਤਣਾਅ ਜਵਾਬ ਦੇਣ ਵਾਲਿਆਂ, PACT ਅਤੇ PKR ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਕੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲ ਤਣਾਅ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।PACT ਨਾਲ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗੱਲਬਾਤ ਕਰਕੇ, DARS-AS1 ਨੇ PACT-ਵਿਚੋਲਗੀ ਵਾਲੇ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਐਪੋਪਟੋਟਿਕ ਸੈੱਲ ਦੀ ਮੌਤ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 5f).DARS-AS1 ਦਾ ਅਪਗ੍ਰੇਗੂਲੇਸ਼ਨ ਕਈ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਤਣਾਅਪੂਰਨ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਬਚਾਅ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਦਾ ਕੰਮ ਕਈ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰਾਂ 'ਤੇ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
PACT ਨੂੰ ਇੱਕ PKR ਐਕਟੀਵੇਟਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ PACT-ਵਿਚੋਲਗੀ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ, ਅਨੁਵਾਦ, ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ, ਅਤੇ ਹੋਰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਕੇ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੀ ਹੈ62।ਦਹਾਕਿਆਂ ਤੋਂ, PACT-PKR ਕੈਸਕੇਡ ਦੇ ਕੈਂਸਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਨਿਯਮ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਦੀਆਂ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ਾਂ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ।ਇੱਥੇ, ਸਾਡੇ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਸੈਲੂਲਰ lncRNA DARS-AS1 ਦੁਆਰਾ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ PACT-PKR ਦੇ ਨਿਯੰਤ੍ਰਣ ਦੀ ਇੱਕ ਵੱਖਰੀ ਵਿਧੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ, ਜੋ PACT ਨਾਲ ਸਿੱਧਾ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, PACT-PKR ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਅਤੇ eIF2α ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਤਣਾਅ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ apoptosis ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ। ਅੰਤਮ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨਾ।ਸੈੱਲ.ਇਹ ਖੋਜ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਅਤੇ ਥੈਰੇਪੀ ਲਈ ਸੰਭਾਵੀ lncRNA ਟੀਚਿਆਂ 'ਤੇ ਰੌਸ਼ਨੀ ਪਾਉਂਦੀ ਹੈ।
ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 ਨਾਕਡਾਊਨ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ PKR ਅਤੇ eIF2α ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧੇ ਦੇ ਨਾਲ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੀਰਮ ਭੁੱਖਮਰੀ ਲਈ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ DARS-AS1 PACT/PKR ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕ ਕੇ ਕਠੋਰ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਬਚਾਅ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਕਈ ਹੋਰ ਗੈਰ-ਕੋਡਿੰਗ RNAs, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ASPACT ਅਤੇ nc886, PACT48 mRNA ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਜਾਂ PKR49,50,64 ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਕੇ ਆਟੋਫੋਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਕੇ PACT/PKR ਧੁਰੇ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, DARS-AS1 PACT-PKR ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਦੇ ਵਿਘਨਕਾਰੀ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਅਧਿਐਨ PACT/PKR ਐਕਸਿਸ ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਤਣਾਅ ਦੇ ਜਵਾਬਾਂ ਵਿੱਚ lncRNAs ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਬਾਰੇ ਸਾਡੀ ਸਮਝ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ।
PACT ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਵੱਖਰੇ ਡੋਮੇਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਪਹਿਲੇ ਦੋ dsRBDs ਵਿੱਚੋਂ ਹਰ ਇੱਕ PACT ਦੀ PKR ਨਾਲ ਉੱਚ ਸਾਂਝ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਫੀ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਤੀਜਾ ਡੋਮੇਨ (D3) ਵਿਟਰੋ ਅਤੇ ਵੀਵੋ ਵਿੱਚ PKR ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ DARS-AS1 ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ D3 ਡੋਮੇਨ (ਚਿੱਤਰ 3h) ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।lncRNA (768 ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਜ਼) ਦੇ ਵੱਡੇ ਆਕਾਰ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, DARS-AS1 D3 ਨਾਲ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਰੀਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ dsRBD ਅਤੇ PKR ਦੇ PACT ਡੋਮੇਨ ਵਿਚਕਾਰ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ PACT ਅਤੇ PKR ਦੇ ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।PACT ਪੁਆਇੰਟ ਪਰਿਵਰਤਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੇ Ser246 ਅਤੇ Ser287 ਨੂੰ D3 ਵਿੱਚ ਅਲਾਨਾਈਨ ਜਾਂ ਐਸਪਾਰਟੇਟ ਨਾਲ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ, DARS-AS1 ਲਈ ਇਸਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਵਿਗਾੜ ਦਿੱਤਾ, ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ D3 ਦੇ ਸਮੁੱਚੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਵੱਲ ਇਸ਼ਾਰਾ ਕੀਤਾ।ਭਵਿੱਖ ਵਿੱਚ ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੇ ਹੋਰ ਵੇਰਵਿਆਂ ਦੀ ਲੋੜ ਪਵੇਗੀ, ਵਧੇਰੇ ਸਟੀਕ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਉੱਚ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ PACT ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ।
ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦੱਸਿਆ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 ਕਈ ਵਿਧੀਆਂ 51,52,53 ਦੁਆਰਾ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਨ ਵਿੱਚ, ਜਾਂਚਕਰਤਾਵਾਂ ਨੇ ਦੇਖਿਆ ਕਿ DARS-AS1 ਨੇ ਗੁਰਦੇ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ miP-194-5p ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾ ਕੇ ਆਪਣੇ ਐਂਟੀਸੈਂਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਏਨਕੋਡਿੰਗ DARS ਜੀਨ ਨੂੰ ਉੱਚਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਮੌਜੂਦਾ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, DARS-AS1 ਨੋਕਡਾਊਨ ਦਾ ਕਈ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਕੈਂਸਰਾਂ ਵਿੱਚ DARS ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਕੋਲੋਰੈਕਟਲ, ਛਾਤੀ ਅਤੇ ਜਿਗਰ ਦੇ ਕੈਂਸਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਕਿਉਂਕਿ lncRNAs ਸੈੱਲ- ਅਤੇ ਟਿਸ਼ੂ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਟਰਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਕੈਂਸਰ ਦੀਆਂ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਸਾਡੇ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕੈਂਸਰਾਂ ਦੇ ਪਿਛਲੇ ਮੁਲਾਂਕਣਾਂ ਵਿੱਚ ਇਸ ਅੰਤਰ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਰੀਰਕ ਅਤੇ ਰੋਗ ਸੰਬੰਧੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਖਾਸ ਤੰਤਰ ਨੂੰ ਸਪਸ਼ਟ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਅਧਿਐਨਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਕਲੀਨਿਕਲ ਡੇਟਾ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ DARS-AS1 ਸਮੀਕਰਨ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਬਚਾਅ ਨਾਲ ਉਲਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਬੰਧਿਤ ਹੈ, ਜੋ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਵਿੱਚ DARS-AS1/PACT/PKR ਧੁਰੇ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਰੇਖਾਂਕਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਸਾਡਾ ਅਧਿਐਨ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ DARS-AS1 PACT/PKR ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਧੁਰੀ ਦਾ ਇੱਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰ ਹੈ, ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਅਪੋਪਟੋਸਿਸ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਖੋਜ ਦੀ ਇੱਕ ਹੋਰ ਲਾਈਨ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵੀ ਇਲਾਜਾਂ ਵਿੱਚ ਭਵਿੱਖ ਦੀ ਖੋਜ ਲਈ ਦਿਲਚਸਪੀ ਰੱਖਦਾ ਹੈ। .
ਮਨੁੱਖੀ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ਅਤੇ HEK293T ਚੀਨ ਵਿੱਚ ਨੈਸ਼ਨਲ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਸਰੋਤ ਬੁਨਿਆਦੀ ਢਾਂਚੇ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ।ਸਾਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ DMEM ਮਾਧਿਅਮ (DMEM, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਵਾਲਥਮ, MA) ਵਿੱਚ 10% FBS (ਜੇਮਿਨੀ, ਬਰੁਕਲਿਨ, NY) ਅਤੇ 1% ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ-ਸਟਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) 37°C, 5% CO2 ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਵਿੱਚ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਨਕਿਊਬੇਟਰ
ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ, ਐਬਕੈਮ (ab31967);ਐਂਟੀ-ਪੀਕੇਆਰ, ਐਬਕੈਮ (ab184257);ਐਂਟੀ-ਪੀਕੇਆਰ (ਫੋਸਫੋ-ਟੀ451), ਐਬਕੈਮ (ab81303);ਐਂਟੀ-ਫਲੈਗ, ਐਬਕੈਮ (ab125243);ਐਂਟੀ-eIF2α, ਐਬਕੈਮ (A0764));ਐਂਟੀ-eIF2α (ਫਾਸਫੋਰਸ S51), ਐਬਕੈਮ (ab32157);ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ (ਫਾਸਫੋਰਸ S246), ਐਬਜੈਂਟ (AP7744b);ਐਂਟੀ-β-ਟਿਊਬਲਿਨ, CST (2128);ਸਧਾਰਨ ਮਾਊਸ IgG, CST (5415S);ਸਧਾਰਨ ਖਰਗੋਸ਼ IgG, CST (2729S)।ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨੂੰ ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ ਲਈ PBST ਵਿੱਚ 1:1000 ਅਤੇ IP ਲਈ 1:100 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
sgRNAs ਨੂੰ CRISPR-ERA66 ਨਾਮਕ ਜਨਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਪਲਬਧ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਅਸੀਂ sgRNA ਵਿਕਾਸ ਲਈ ਡਿਫੌਲਟ ਟੂਲ ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਅਤੇ 3 kb ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ sgRNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਹੈ।TSS 'ਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ।sgRNA oligonucleotides ਦੇ ਪੂਲ ਨੂੰ CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ਵਿਖੇ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀਕ੍ਰਿਤ pgRNA ਪਲਾਜ਼ਮੀਡਾਂ (Addgene #44248) ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕੁੱਲ 12 µg ਪੂਲਡ ਹਿਊਮਨਾਈਜ਼ਡ pgRNA ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), ਅਤੇ 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) ਨੂੰ 5 x 106 HEK106 HEK293cm ਦੇ ਡਿਸਫੇਕਸ਼ਨ ਡੀ. ਸੈੱਲ (CWBIO, ਬੀਜਿੰਗ, ਚੀਨ) ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਿਦਾਇਤਾਂ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ।ਵਾਇਰਸ ਵਾਲੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟਸ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ 48 ਅਤੇ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 0.45 µm ਫਿਲਟਰ ਦੁਆਰਾ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਲਈ, dCas9/KRAB ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ SW620 ਸੈੱਲ ਵਾਇਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ SW620 ਸੈੱਲ 0.1-0.3 ਦੇ ਇੱਕ MOI 'ਤੇ ਚਾਰ ਸੁਤੰਤਰ ਸੰਕਰਮਣ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ ਹੋਏ ਸਨ ਅਤੇ 2 ਦਿਨਾਂ ਲਈ 2 μg/ml ਪਿਓਰੋਮਾਈਸਿਨ (ਸਿਗਮਾ, ਸੇਂਟ ਲੁਈਸ, MO) ਨਾਲ ਨਮੂਨਾ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਲਈ 500 ਸੈੱਲਾਂ/sgRNA ਦੀ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਕਵਰੇਜ ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ 18 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ QIAamp ਡੀਐਨਏ ਬਲੱਡ ਮਿਡੀ ਕਿੱਟ (QIAGEN, ਡੁਸੇਲਡੋਰਫ, ਜਰਮਨੀ; 51183) ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ 100 μg ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਪ੍ਰਤੀ ਜੈਵਿਕ ਦੁਹਰਾਓ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।sgRNA ਖੇਤਰ ਨੂੰ PCR ਦੇ ਦੋ ਗੇੜਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਬਾਰਕੋਡ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
PCR ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ NucleoSpin® ਜੈੱਲ ਅਤੇ PCR ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਕਿੱਟ (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ Qubit™ HS ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਖੋਜ ਕਿੱਟ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ; Q32854) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
MTS ਪਰਖ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੈੱਲ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 2000 ਸੈੱਲਾਂ/ਖੂਹ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਘਣਤਾ 'ਤੇ 96-ਖੂਹ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਸੀਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਅਨੁਸਾਰੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਕੁੱਲ 4-6 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਦਰਸਾਏ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਰੋਜ਼ਾਨਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਲਈ, 20 μl MTS ਰੀਏਜੈਂਟ (ਪ੍ਰੋਮੇਗਾ) ਨੂੰ 100 μl DMEM ਨਾਲ ਪੇਤਲੀ ਪੈ ਗਿਆ, 37°C 'ਤੇ 4 ਘੰਟੇ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ OD490 ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ।
ਗੋਲਿਆਂ ਦੇ ਗਠਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਕੇ ਅਣਐਂਕਰਡ ਵਾਧੇ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਦੀ ਖੋਜ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, shRNA DARS-AS1 ਜਾਂ ਨਿਯੰਤਰਣ shRNA ਨਾਲ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤੇ ਗਏ 2000 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਹਰ 4 ਦਿਨਾਂ ਵਿੱਚ ਦਰਮਿਆਨੇ ਬਦਲਾਅ ਦੇ ਨਾਲ ਅਤਿ ਘੱਟ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟਾਂ (ਕੋਰਨਿੰਗ) ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਗੋਲਾਕਾਰ 14 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ।DARS-AS1 ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਜਾਂ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਟ ਕੀਤੇ 500 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੁਧਾਰ ਪਰਖ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਨਹੀਂ ਤਾਂ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਬਦਲਿਆ ਨਹੀਂ ਗਿਆ ਸੀ।
RNA ਨੂੰ T7 RNA ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਅਤੇ ਬਾਇਓਟਿਨ-16-UTP (Roche 1138908910) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਥੇ ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 4 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਕੋਡਿੰਗ PACT ਜਾਂ PKR ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ pET15b (Addgene #73619) ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ BL21 (DE3) ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਨੂੰ ਐਂਪਿਸਿਲਿਨ ਨਾਲ ਸਪਲਾਈ ਕੀਤੇ ਗਏ LB ਵਿੱਚ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਫਿਰ ਤਾਜ਼ੇ LB ਨਾਲ 100 ਗੁਣਾ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਜਦੋਂ ਮਾਧਿਅਮ ਦਾ OD600 0.8 ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਗਿਆ, ਤਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ 1 mM IPTG ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ।ਕੋਮਲ ਹਿੱਲਣ (20°C 'ਤੇ 250 rpm) ਦੇ ਨਾਲ ਰਾਤ ਭਰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ (4000 rpm, 10 ਮਿੰਟ, 4°C) ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਮੁੜ-ਸਪੈਂਡ ਕਰੋ ਅਤੇ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ, ਫਿਰ ਸੋਨੀਕੇਟ (15 ਮਿੰਟ, 5 s ਚਾਲੂ/ਬੰਦ, ਬਰਫ਼ 'ਤੇ) ਅਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ (1300, rpm)।, 30 ਮਿੰਟ, 4°С)।ਫਿਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 3 ਵਾਰ ਨੀ-ਐਨਟੀਏ ਰੈਜ਼ਿਨ (ਕਿਊਆਈਜੇਨ) 'ਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਵਾਸ਼ ਬਫਰ (50 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ, ਪੀਐਚ 8.0, 40 ਐਮਐਮ ਇਮੀਡਾਜ਼ੋਲ, 250 ਐਮਐਮ ਨਾਸੀਐਲ) ਨਾਲ 4 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ 3 ਵਾਰ ਅਲਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। 10 ਮਿ.ਲੀ. ਐਲੂਐਂਟ ਬਫਰ (50 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ, pH 8.0, 250 ਐਮਐਮ NaCl, 300 ਐਮਐਮ ਇਮੀਡਾਜ਼ੋਲ) ਦਾ।ਸ਼ੁੱਧ ਪ੍ਰੋਟੀਨ WB ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕਿਊਬਿਟ™ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਸੇ ਕਿੱਟ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ; Q 33212) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
RIP ਅਸੈਸ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਸੋਧਾਂ ਦੇ ਨਾਲ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, 1x RIP ਬਫਰ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ 1000 ਐੱਮ.ਐੱਮ. (Roche, 1 mM DTT) ਅਤੇ 4 °C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ 13,000 rpm 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ।ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਫਿਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ A+G ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ (ਮਿਲੀਪੋਰ) ਨਾਲ 5 μg ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਏਬੀਮ) ਜਾਂ ਆਈਜੀਜੀ (ਸੀਐਸਟੀ) ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ 5x RIP ਬਫਰ ਨਾਲ 5 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਫਿਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨੇਸ ਕੇ (NEB) ਨਾਲ ਹਜ਼ਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।RNA ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਈਜ਼ੋਲ ਨਾਲ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ RT-qPCR ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਟੇਬਲ 5 ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।
ਇਨ ਵਿਟਰੋ RIP ਪਰਖ ਇੱਕ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਮਿਆਰੀ RIP ਪਰਖ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਡ RNA ਦੇ ਕੁੱਲ 5 pmol ਨੂੰ RIP ਬਫਰ ਨਾਲ 1x ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 65°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਐਨੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹੌਲੀ ਕੂਲਿੰਗ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਕੁੱਲ 5 pmol ਬਰਕਰਾਰ ਜਾਂ ਪਰਿਵਰਤਿਤ ਫਲੈਗ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ PACT ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਈ. ਕੋਲੀ ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪੁਨਰ-ਨਿਰਮਾਤ RNA ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ ਅਤੇ ਐਂਟੀ-ਫਲੈਗ IP ਲਈ RIP ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਉਪਰੋਕਤ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰੋ।
RNA ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, 1xRIP ਬਫਰ ਨਾਲ 1×107 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।4°C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ 13,000 rpm 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 2 ਘੰਟੇ ਲਈ 30 μl ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਮੈਗਨੈਟਿਕ ਬੀਡਜ਼ (ਬੇਕਮੈਨ) ਨਾਲ ਪ੍ਰੀ-ਟਰੀਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਸ਼ੁੱਧ ਲਾਈਸੇਟ ਨੂੰ ਫਿਰ ਖਮੀਰ tRNA ਨਾਲ ਸਪਲਾਈ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ 4° C 'ਤੇ 40 pmol renatured RNA ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਫਿਰ ਹੋਰ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਅਤੇ BSA ਨਾਲ ਬਲੌਕ ਕੀਤੇ ਨਵੇਂ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ 20 μl ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ।ਵਾਸ਼ਿੰਗ ਸਟੈਪ ਵਿੱਚ 5x RIP ਬਫਰ ਦੇ ਨਾਲ 4 ਵਾਰ ਅਤੇ 1x RIP ਬਫਰ ਦੇ ਨਾਲ 4 ਵਾਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਅਨੁਸਾਰੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਬਾਇਓਟਿਨ ਇਲਿਊਸ਼ਨ ਬਫਰ (25 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ, ਪੀਐਚ 7.5, 12.5 ਐਮਐਮ ਡੀ-ਬਾਇਓਟਿਨ, ਪੀਐਮਐਸਐਫ) ਨਾਲ ਅਲਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਨੂਪੇਜ 4-12% ਬਿਸ-ਟ੍ਰਿਸ ਜੈੱਲ (ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ) 'ਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਿਲਵਰ ਸਟੈਨਿੰਗ (ਬੀਓਟਾਈਮ ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੋਜੀ) ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਕੁਝ ਬੈਂਡਾਂ ਨੂੰ ਐਕਸਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਐਮਐਸ ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਕੋ-ਆਈਪੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ PACT ਅਤੇ PKR ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਪਰਖਣ ਲਈ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, 1 x RIP ਬਫਰ ਵਿੱਚ 1 x 107 ਲਾਈਜ਼ਡ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਕੇ, 13,000 rpm 'ਤੇ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਲਾਈਸੈਟਸ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਲਾਈਸੇਟਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ A + G ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਨਾਲ ਲੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, 5 µg ਐਂਟੀ-ਪੀਏਸੀਟੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਸੰਯੁਕਤ ਸਨ, ਅਤੇ ਹੌਲੀ ਹੌਲੀ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਰਾਤ ਭਰ ਘੁੰਮਦੇ ਸਨ।ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ 5×RIP ਬਫ਼ਰ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ, 1×RIP ਬਫ਼ਰ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਅਤੇ 1×SDS ਬਫ਼ਰ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ।ਬਰਾਮਦ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ SDS-PAGE ਜੈੱਲ ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ WB ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਫਲੈਗਡ PACT ਦੇ ਦੋ pmol ਅਤੇ PKR ਦੇ 1 pmol ਨੂੰ ਈ. ਕੋਲੀ ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।1× RIP ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰੋ ਅਤੇ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 10 pmol renatured RNA ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ।ਉਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ A+G ਮੈਗਨੈਟਿਕ ਬੀਡ-ਕੰਜੁਗੇਟਿਡ ਐਂਟੀ-ਲੇਬਲਡ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਵਾਧੂ ਦੋ ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ ਫਿਰ 1x RIP ਬਫਰ ਨਾਲ ਚਾਰ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 1x SDS ਬਫਰ ਨਾਲ ਅਲੋਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ PACT ਅਤੇ PKR WB ਦੁਆਰਾ ਖੋਜੇ ਗਏ ਸਨ।