Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ।ਤੁਹਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਜਾ ਰਹੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਸੀਮਿਤ CSS ਸਮਰਥਨ ਹੈ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)।ਇਸ ਦੌਰਾਨ, ਨਿਰੰਤਰ ਸਮਰਥਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ ਜਾਵਾ ਸਕ੍ਰਿਪਟ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਰੈਂਡਰ ਕਰਾਂਗੇ।
ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਏਸਟਰਾਂ ਜਾਂ ਫੀਨੌਕਸੀ ਰੈਡੀਕਲਸ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਨੇੜਤਾ ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਜੀਵਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰੈਕਟਰਾਂ ਨੂੰ ਮੈਪ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਐਸਟਰ ਘੱਟ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਲੇਬਲਿੰਗ ਰੇਡੀਅਸ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਪੈਰੋਕਸਾਈਡ ਇਲਾਜ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਹੋਏ ਫੀਨੋਕਸੀ ਰੈਡੀਕਲਸ ਰੈਡੌਕਸ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਦਖਲ ਦੇ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਦਿਲਚਸਪੀ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੋੜ ਕੇ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤੇ ਨੇੜਤਾ ਲੇਬਲਿੰਗ ਨਿਰਭਰ ਫੋਟੋਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ (PDPL) ਵਿਧੀ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਐਕਸਪੋਜਰ ਟਾਈਮ ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਉਤਪੰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਰ ਐਨੀਲਿਨ ਜਾਂਚ ਦੁਆਰਾ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਸਪੈਟੀਓਟੈਂਪੋਰਲੀ ਹੱਲ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਆਰਗੇਨੇਲ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਮੈਪਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਇਸਦੀ ਉੱਚ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।TurboID ਦੇ ਨਾਲ PDPL ਦੀ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ PDPL ਦੀ ਵਧੇਰੇ ਖਾਸ ਅਤੇ ਵਿਆਪਕ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਕਵਰੇਜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਅਗਲਾ, ਅਸੀਂ PDPL ਨੂੰ ਬਿਮਾਰੀ-ਸਬੰਧਤ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਕੋਐਕਟੀਵੇਟਰ BRD4 ਅਤੇ E3 ਪਾਰਕਿਨ ਲਿਗੇਸ ਲਈ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਅਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਅਣਜਾਣ ਇੰਟਰੈਕਟਰ ਲੱਭੇ।ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੁਆਰਾ, ਪਾਰਕਿਨ ਲਈ ਦੋ ਅਣਜਾਣ ਸਬਸਟਰੇਟਸ, Ssu72 ਅਤੇ SNW1, ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸਦੀ ਗਿਰਾਵਟ ਨੂੰ ਸਰਵ-ਵਿਗਿਆਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਸੋਮ ਮਾਰਗ ਦੁਆਰਾ ਮੱਧਮ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਦੀ ਸਹੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਕਈ ਬੁਨਿਆਦੀ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਬਹੁਤ ਹੀ ਸਟੀਕ ਸਪੈਟੀਓਟੇਮਪੋਰਲ ਮੈਪਿੰਗ ਜੈਵਿਕ ਮਾਰਗਾਂ, ਰੋਗ ਰੋਗ ਵਿਗਿਆਨ, ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਦੇ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ ਇਹਨਾਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਵਿਗਾੜਨ ਲਈ ਇੱਕ ਅਣੂ ਆਧਾਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰੇਗੀ।ਇਸ ਲਈ, ਜੀਵਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਜਾਂ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਅਸਥਾਈ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੇ ਯੋਗ ਢੰਗ ਬਹੁਤ ਫਾਇਦੇਮੰਦ ਹਨ।ਐਫੀਨਿਟੀ ਪਿਊਰੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੈਟਰੀ (ਏਪੀ-ਐਮਐਸ) ਇਤਿਹਾਸਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦਿਲਚਸਪੀ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਪੀਓਆਈ) ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਿਧੀਆਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਦੇ ਨਾਲ, ਬਾਇਓਪਲੇਕਸ 3.0 ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਏਪੀ-ਐਮਐਸ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਦਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਡਾ ਡੇਟਾਬੇਸ।ਹਾਲਾਂਕਿ AP-MS ਬਹੁਤ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਹੈ, ਵਰਕਫਲੋ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਲਾਈਸਿਸ ਅਤੇ ਪਤਲੇ ਕਦਮ ਕਮਜ਼ੋਰ ਅਤੇ ਅਸਥਾਈ ਬਾਈਡਿੰਗ ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨਾਂ ਪ੍ਰਤੀ ਪੱਖਪਾਤੀ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਪੋਸਟ-ਲਾਈਸਿਸ ਆਰਟਿਫੈਕਟਸ ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਜਾਅਲੀ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਜੋੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਲਿਸਿਸ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੀ ਘਾਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਇਹਨਾਂ ਮੁੱਦਿਆਂ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਗੈਰ-ਕੁਦਰਤੀ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ (UAA) ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਸਮੂਹਾਂ ਅਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਲੇਬਲਿੰਗ (PL) ਪਲੇਟਫਾਰਮਾਂ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ APEX ਅਤੇ BioID)5 ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ UAA ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਦ੍ਰਿਸ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਸਿੱਧੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਡੈਸਿਵਾਂ ਬਾਰੇ ਜਾਣਕਾਰੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ, UAA ਸੰਮਿਲਨ ਸਾਈਟ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਦੀ ਅਜੇ ਵੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਵਧੇਰੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ, ਇਹ ਇੱਕ ਸਟੋਈਚਿਓਮੈਟ੍ਰਿਕ ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਲੇਬਲਿੰਗ ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੇ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਉਲਟਣ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ।ਇਸਦੇ ਉਲਟ, ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ PL ਵਿਧੀਆਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਬਾਇਓਆਈਡੀ ਵਿਧੀ, ਇੰਜਨੀਅਰਡ ਬਾਇਓਟਿਨ ਲੀਗੇਸ ਨੂੰ POI7 ਵਿੱਚ ਫਿਊਜ਼ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲ-ਏਐਮਪੀ ਐਸਟਰ ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਬਾਇਓਟਿਨ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਇੱਕ ਸਰਗਰਮ ਬਾਇਓਟਿਨ "ਕਲਾਊਡ" ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਜਾਰੀ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਕਿ ਪ੍ਰੌਕਸੀਮਲ ਲਾਈਸਿਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਬਾਇਓਆਈਡੀ ਨੂੰ ਲੋੜੀਂਦਾ ਲੇਬਲ ਸਿਗਨਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ 12 ਘੰਟਿਆਂ ਤੋਂ ਵੱਧ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਅਸਥਾਈ ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਨਾਲ ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।ਖਮੀਰ ਡਿਸਪਲੇਅ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਵਿਕਾਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਟਰਬੋਆਈਡੀ ਨੂੰ ਬਾਇਓਆਈਡੀ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਵਧੇਰੇ ਕੁਸ਼ਲ ਹੋਣ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਨਾਲ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਬਾਇਓਟਿਨ ਦੇ ਨਾਲ ਕੁਸ਼ਲ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਵਧੇਰੇ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਟਰਬੋਆਈਡੀ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੈ ਅਤੇ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਬਾਇਓਟਿਨ ਦੇ ਪੱਧਰ ਘੱਟ-ਪੱਧਰੀ ਲੇਬਲਿੰਗ ਲਈ ਕਾਫੀ ਹਨ, ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਲੇਬਲਿੰਗ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਸਮੱਸਿਆ ਬਣ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜਦੋਂ ਐਕਸੋਜੇਨਸ ਬਾਇਓਟਿਨ ਦੇ ਜੋੜ ਦੁਆਰਾ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਅਤੇ ਸਮਾਂਬੱਧ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਐਸਟਰ ਮਾੜੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (t1/2 ~ 5 ਮਿੰਟ), ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਲੇਬਲਿੰਗ ਰੇਡੀਅਸ ਵੱਲ ਅਗਵਾਈ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਾਇਓਟਿਨ 5 ਦੇ ਨਾਲ ਗੁਆਂਢੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ। ਇੱਕ ਹੋਰ ਪਹੁੰਚ ਵਿੱਚ, ਇੰਜਨੀਅਰਡ ਐਸਕੋਰਬੇਟ ਪੇਰੋਕਸੀਡੇਸ (ਭਾਵ ਬਾਇਓਟਿਨ-) ਦਾ ਜੈਨੇਟਿਕ ਫਿਊਜ਼ਨ। ਫਿਨੋਲ ਰੈਡੀਕਲਸ ਅਤੇ ਇੱਕ ਮਿੰਟ 9,10 ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। APEX ਦੀ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ, ਝਿੱਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸ, ਅਤੇ ਸਾਈਟੋਸੋਲਿਕ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸ 11,12 ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਪਰਆਕਸਾਈਡਾਂ ਦੀ ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਰੇਡੌਕਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਾਂ ਮਾਰਗਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਵਿਘਨ ਪਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ.
ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਸੈਲੂਲਰ ਮਾਰਗਾਂ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਘਨ ਪਾਏ ਬਿਨਾਂ ਉੱਚ ਸਥਾਨਿਕ ਅਤੇ ਅਸਥਾਈ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਵਧੇਰੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਲੇਬਲ-ਰੇਡੀਅਸ ਦਮਨ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਤਰੀਕਾ ਮੌਜੂਦਾ ਤਰੀਕਿਆਂ ਲਈ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਜੋੜ ਹੋਵੇਗਾ। ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ, ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਨੇ ਆਪਣੇ ਛੋਟੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਅਤੇ ਸੀਮਤ ਫੈਲਾਅ ਦੇ ਘੇਰੇ (ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ t1/2 <0.6 µs) 13 ਕਾਰਨ ਸਾਡਾ ਧਿਆਨ ਜਗਾਇਆ। ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ, ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਨੇ ਆਪਣੇ ਛੋਟੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਅਤੇ ਸੀਮਤ ਫੈਲਾਅ ਦੇ ਘੇਰੇ (ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ t1/2 <0.6 µs) 13 ਕਾਰਨ ਸਾਡਾ ਧਿਆਨ ਜਗਾਇਆ। Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного ограниченного, ограниченного и ограниченного , ограниченного/ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਰੂਪਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਨੇ ਆਪਣੇ ਛੋਟੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਅਤੇ ਸੀਮਤ ਫੈਲਾਅ ਰੇਡੀਅਸ (ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ t1/2 <0.6 µs) 13 ਕਾਰਨ ਸਾਡਾ ਧਿਆਨ ਖਿੱਚਿਆ।在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 的 0.6 µs）争耵. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни , ограниченноги и ограниченногода/ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਰੂਪਾਂ ਵਿੱਚ, ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਆਪਣੇ ਛੋਟੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਅਤੇ ਸੀਮਤ ਫੈਲਾਅ ਰੇਡੀਅਸ (ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ t1/2 <0.6 μs) ਦੇ ਕਾਰਨ ਸਾਡਾ ਧਿਆਨ ਖਿੱਚਦੀ ਹੈ।ਸਿੰਗਲ ਆਕਸੀਜਨ ਨੂੰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ, ਟਾਈਰੋਸਾਈਨ, ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਅਤੇ ਟ੍ਰਿਪਟੋਫੈਨ ਨੂੰ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ ਕਰਨ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਇਸ ਨੂੰ ਅਮੀਨ ਜਾਂ ਥਿਓਲ ਆਧਾਰਿਤ ਜਾਂਚਾਂ 16,17 ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਲਈ ਪੋਲਰ 14,15 ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਪਰ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਪੀਓਆਈ ਨੇੜਤਾ ਮਾਰਕਰਾਂ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੀਆਂ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਅਣਪਛਾਤੀਆਂ ਹਨ।ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜਿਸਨੂੰ ਫੋਟੋਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ-ਨਿਰਭਰ ਨੇੜਤਾ ਲੇਬਲਿੰਗ (PDPL) ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ ਅਸੀਂ ਇੱਕ miniSOG ਫੋਟੋਸੈਂਸਟਾਈਜ਼ਰ ਨਾਲ ਫਿਊਜ਼ ਕੀਤੇ POIs ਨੂੰ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਮਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰੌਕਸੀਮਲ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਟਰਿੱਗਰ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚਾਂ ਵਿੱਚ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਅਮੀਨ-ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਸੋਧਾਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ। ਵਿਚਕਾਰਲੇ ਜੀਵਤ ਸੈੱਲ..ਅਸੀਂ ਟੈਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਰਨ ਲਈ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਓਪਨ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਰਕਫਲੋ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੋਧ ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ।TurboID ਦੇ ਨਾਲ PDPL ਦੀ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ PDPL ਦੀ ਵਧੇਰੇ ਖਾਸ ਅਤੇ ਵਿਆਪਕ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਕਵਰੇਜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਇਸ ਪਹੁੰਚ ਨੂੰ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦੇ ਆਰਗੇਨੇਲ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਮਾਰਕਰਾਂ ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ-ਸਬੰਧਤ ਐਪੀਜੇਨੇਟਿਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ BRD4 ਅਤੇ ਪਾਰਕਿਨਸਨ ਰੋਗ-ਸਬੰਧਤ E3 ਲੀਗੇਸ ਪਾਰਕਿਨ ਲਈ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪਾਰਟਨਰ ਦੀ ਜਨਰਲ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਪਛਾਣ ਲਈ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ, ਜਿਸ ਨੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਜਾਣੇ ਅਤੇ ਅਣਜਾਣ ਨੈਟਵਰਕ ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ। ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ.ਵੱਡੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ E3 ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਨੂੰ ਪਛਾਣਨ ਲਈ PDPL ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਇੱਕ ਅਜਿਹੀ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਜਿੱਥੇ ਅਸਿੱਧੇ ਬਾਈਂਡਰਾਂ ਦੀ ਮਾਨਤਾ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ubiquitination-proteasome ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਵਾਲੇ ਦੋ ਅਣਜਾਣ ਪਾਰਕਿਨ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿਚ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।
ਫੋਟੋਡਾਇਨਾਮਿਕ ਥੈਰੇਪੀ (PDT) 19 ਅਤੇ ਕ੍ਰੋਮੋਫੋਰ-ਸਹਾਇਕ ਲੇਜ਼ਰ ਇਨਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ (CALI) 20, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰਾਂ ਨਾਲ ਹਲਕੀ ਕਿਰਨਾਂ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਪੈਦਾ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ ਜਾਂ ਸੈੱਲ ਦੀ ਮੌਤ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ।ਕਿਉਂਕਿ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਲਗਭਗ 70 nm ਦੀ ਸਿਧਾਂਤਕ ਪ੍ਰਸਾਰ ਦੂਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਪਦਾਰਥ ਹੈ, ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਸਥਾਨਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੀਮਤ ਆਕਸੀਕਰਨ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਧਾਰਨਾ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਜੀਵਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਲੇਬਲਿੰਗ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦਾ ਫੈਸਲਾ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਚਾਰ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ PDPL ਕੀਮੋਪ੍ਰੋਟੋਮਿਕ ਪਹੁੰਚ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤੀ ਹੈ: (1) PL ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਪਹੁੰਚ ਦੇ ਸਮਾਨ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੀ ਉਤਪੱਤੀ ਲਈ;(2) ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ 'ਤੇ ਸਮਾਂ-ਸੁਲਝੇ ਹੋਏ ਲੇਬਲਿੰਗ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰੋ;(3) ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੁਆਰਾ (4) ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਕੋਫੈਕਟਰ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਬਾਇਓਟਿਨ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਰਹੇਜ਼ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਵਾਤਾਵਰਣ ਦੇ ਤਣਾਅ ਦੇ ਸੈੱਲ ਐਕਸਪੋਜਰ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪਰੇਸ਼ਾਨ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਐਕਸੋਜੇਨਸ ਰੀਐਜੈਂਟਸ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੈਰੋਕਸਾਈਡ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰਾਂ ਨੂੰ ਦੋ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਅਣੂ ਭਾਰ ਵਾਲੇ ਫਲੋਰੋਫੋਰਸ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਰੋਜ਼ ਬੇਂਗਲ, ਮਿਥਾਈਲੀਨ ਨੀਲਾ) 22 ਅਤੇ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਛੋਟੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ, ਕਿਲਰਰੇਡ) 23 ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਇੱਕ ਮਾਡਿਊਲਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ POI24,25 (ਚਿੱਤਰ 1a) ਵਿੱਚ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ (PS) ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੋੜ ਕੇ ਪਹਿਲੀ ਪੀੜ੍ਹੀ ਦਾ PDPL ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨਾਲ ਕਿਰਨੀਕਰਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਪ੍ਰਾਕਸੀਮਲ ਨਿਊਕਲੀਓਫਿਲਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਇੱਕ ਉਮਪੋਲੰਗ ਪੋਲਰਿਟੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਲਿਕ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਅੱਗੇ ਅਮੀਨ ਪ੍ਰੋਬ ਨਿਊਕਲੀਓਫਾਈਲਜ਼ 16,17 ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਪੜਤਾਲ ਨੂੰ ਇੱਕ ਐਲਕਾਈਨ ਹੈਂਡਲ ਨਾਲ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਕਲਿਕ ਕੈਮਿਸਟਰੀ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ ਜਾ ਸਕੇ ਅਤੇ LC/MS/MS ਚਰਿੱਤਰੀਕਰਨ ਲਈ ਹੇਠਾਂ ਖਿੱਚਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।
miniSOG ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਦ੍ਰਿਸ਼ਟਾਂਤ।ਜਦੋਂ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਆਉਂਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ miniSOG-POI ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਸੋਧਦਾ ਹੈ ਪਰ ਗੈਰ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਹੀਂ।ਫੋਟੋਆਕਸੀਡੇਸ਼ਨ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰਲੇ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਅਮਾਈਨ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚ ਦੇ ਰੀਲੇਅ ਲੇਬਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਰੋਕਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਕੋਵਲੈਂਟ ਐਡਕਟਸ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ।ਕੈਮਿਸਟਰੀ ਪ੍ਰੋਬ 'ਤੇ ਅਲਕਾਈਨਾਈਲ ਗਰੁੱਪ ਪੁੱਲ-ਡਾਊਨ ਅਤੇ LC-MS/MS ਕੁਆਂਟੀਟੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਲਈ ਕਲਿਕ ਕੈਮਿਸਟਰੀ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।b ਅਮੀਨ ਜਾਂਚਾਂ ਦੀ ਰਸਾਇਣਕ ਬਣਤਰ 1-4.c ਪ੍ਰੋਬਸ 1-4 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਲੋਕਲਾਈਜ਼ਡ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ-ਵਿਚੋਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਮਾਰਕਰਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਜੈੱਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਡੈਨਸੀਟੋਮੈਟਰੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾ।ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚਾਂ ਦੇ ਸਿਗਨਲ-ਟੂ-ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਅਨੁਪਾਤ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਜਾਂ HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਸਮੀਕਰਨ ਦੇ ਬਿਨਾਂ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।n = 2 ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਨਮੂਨੇ।ਹਰੇਕ ਬਿੰਦੀ ਇੱਕ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।d ਦਰਸਾਏ ਗਏ PDPL ਭਾਗਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰ-ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਪੜਤਾਲ 3 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ PDPL ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਖੋਜ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾਵਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ c.n = 3 ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਨਮੂਨੇ।ਹਰੇਕ ਬਿੰਦੀ ਇੱਕ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਸੈਂਟਰਲਾਈਨਾਂ ਅਤੇ ਮੂਛਾਂ ਮੱਧਮਾਨ ਅਤੇ ± ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਸੀਬੀਬੀ: ਕੂਮਾਸੀ ਬ੍ਰਿਲੀਅਨ ਬਲੂ।e ਦੂਰ-ਲਾਲ Si-DMA ਦਾਗ਼ ਦੇ ਨਾਲ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੀ ਕਨਫੋਕਲ ਇਮੇਜਿੰਗ।ਸਕੇਲ ਬਾਰ: 10 µm।ਜੈੱਲ ਇਮੇਜਿੰਗ ਅਤੇ ਕਨਫੋਕਲ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਦੋ ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਪਰਿਪੱਕ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ miniSOG26 ਅਤੇ KillerRed23 ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ, ਜੋ ਕਿ HEK293T ਵਿੱਚ ਸਥਿਰ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਇੱਕ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1a) ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦੇ ਪ੍ਰੋਪਾਰਗਾਈਲਾਮਾਈਨ ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਨ ਲਈ।ਜੈੱਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਪੂਰੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਲੇਬਲਿੰਗ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਅਤੇ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਕਿਰਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕਿਲਰਰੇਡ ਨਾਲ ਕੋਈ ਵੀ ਲੇਬਲਿੰਗ ਉਤਪਾਦ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਿਗਨਲ-ਟੂ-ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਐਨੀਲਿਨ (1 ਅਤੇ 3), ਪ੍ਰੋਪਾਈਲਾਮਾਈਨ (2), ਜਾਂ ਬੈਂਜ਼ੀਲਾਮਾਈਨ (4) ਵਾਲੇ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਆਪ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਉੱਚ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਸਿਗਨਲ ਸੀ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਰਿਬੋਫਲੇਵਿਨ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ, ਫਲੈਵਿਨ ਮੋਨੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ (FMN) 27 ਦੇ ਕਾਰਨ। ਐਨੀਲਾਈਨ-ਅਧਾਰਿਤ ਰਸਾਇਣਕ ਪੜਤਾਲਾਂ 1 ਅਤੇ 3 ਨੇ ਬਿਹਤਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਿੱਤੀ ਹੈ, HEK293T ਨੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਵਿੱਚ miniSOG ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ ਜਾਂਚ 3 ਲਈ ਸਿਗਨਲ ਵਿੱਚ >8 ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ RNA-ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿਧੀ CAP-seq ਵਿੱਚ ਵਰਤੀ ਗਈ ਪੜਤਾਲ 2 ਸਿਰਫ ~2.5- ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਫੋਲਡ ਸਿਗਨਲ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ, ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (Fig. 1b, c) ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਤਰਜੀਹਾਂ ਕਾਰਨ। ਐਨੀਲਾਈਨ-ਅਧਾਰਿਤ ਰਸਾਇਣਕ ਪੜਤਾਲਾਂ 1 ਅਤੇ 3 ਨੇ ਬਿਹਤਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਿੱਤੀ ਹੈ, HEK293T ਨੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਵਿੱਚ miniSOG ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ ਜਾਂਚ 3 ਲਈ ਸਿਗਨਲ ਵਿੱਚ >8 ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ RNA-ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿਧੀ CAP-seq ਵਿੱਚ ਵਰਤੀ ਗਈ ਪੜਤਾਲ 2 ਸਿਰਫ ~2.5- ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਫੋਲਡ ਸਿਗਨਲ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ, ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (Fig. 1b, c) ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਤਰਜੀਹਾਂ ਕਾਰਨ।ਐਨੀਲਾਈਨ-ਅਧਾਰਿਤ ਰਸਾਇਣਕ ਪੜਤਾਲਾਂ 1 ਅਤੇ 3 ਨੇ ਬਿਹਤਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਿਖਾਈ: HEK293T, ਜੋ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕਾਂਡਰੀਆ ਵਿੱਚ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਾਂਚ 3 ਲਈ ਸਿਗਨਲ ਵਿੱਚ 8 ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਾਧਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਜਾਂਚ 2, CAP-seq RNA ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਸਿਰਫ ~2.5-ਗੁਣਾ ਸਿਗਨਲ ਵਾਧਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਚਿੱਤਰ 1b, c) ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਤਰਜੀਹਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ।基于 苯胺 3 和 3 和 3 和 3 具有 3 具有 线 粒体 中 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 表达 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 方法 稳定 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法增加 稳定 稳定稳定 稳定 稳定稳定 稳定 稳定稳定 稳定 稳定 方法 方法 方法 方法 方法 cruc 探针 方法 显示 显示 显示 显示 显示 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）।基于 苯胺 3 和 3 和 3 和 3 具有 更 中 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 表达 表达 表达 探针 3 的 3 的 而 于 于 rna 标记-eq 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ _ -倍信号增加，可能是由于RNAਐਨੀਲਾਈਨ-ਅਧਾਰਿਤ ਰਸਾਇਣਕ ਪੜਤਾਲਾਂ 1 ਅਤੇ 3 ਵਿੱਚ ਬਿਹਤਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਸੀ, HEK293T ਨੇ ਮਾਈਟੋਕਾਂਡਰੀਆ ਵਿੱਚ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਦਰਸਾਇਆ, ਅਤੇ ਜਾਂਚ 3 ਨੇ ਸਿਗਨਲ ਵਿੱਚ 8 ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਾਧਾ ਕੀਤਾ, ਜਦੋਂ ਕਿ CAP-seq RNA ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿਧੀ ਲਈ ਪੜਤਾਲ 2 ਨੇ ਸਿਰਫ ~ 2.5 ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਦਿਖਾਇਆ।ਸਿਗਨਲ ਵਿੱਚ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਚਿੱਤਰ 1b, c) ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤਰਜੀਹਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪੜਤਾਲ 3 ਆਈਸੋਮਰਸ ਅਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ੀਨ ਪੜਤਾਲਾਂ (ਪੜਤਾਲ 5, 6, 7) ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਜੋ ਕਿ ਪੜਤਾਲ 3 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1b,c) ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਨ-ਜੈੱਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਹੋਰ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਮਾਪਦੰਡਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ: ਕਿਰਨ ਵੇਵ-ਲੰਬਾਈ (460 nm), ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (1 mM), ਅਤੇ ਕਿਰਨ ਦਾ ਸਮਾਂ (20 ਮਿੰਟ) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2a–c)।PDPL ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਵਿੱਚ ਕਿਸੇ ਵੀ ਹਿੱਸੇ ਜਾਂ ਕਦਮ ਨੂੰ ਛੱਡਣ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ (ਚਿੱਤਰ 1d) ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਿਗਨਲ ਉਲਟਾ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸੋਡੀਅਮ ਅਜ਼ਾਈਡ ਜਾਂ ਟ੍ਰੋਲੌਕਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲੇਬਲਿੰਗ ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਨੂੰ ਬੁਝਾਉਣ ਲਈ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।D2O ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ, ਜੋ ਕਿ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕਰਨ ਲਈ ਜਾਣੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਲੇਬਲਿੰਗ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਲੇਬਲਿੰਗ ਲਈ ਹੋਰ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਆਕਸੀਜਨ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਦੇ ਯੋਗਦਾਨ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, 18, 29, ਕ੍ਰਮਵਾਰ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਲ ਅਤੇ ਸੁਪਰਆਕਸਾਈਡ ਰੈਡੀਕਲ ਸਕੈਵੇਂਜਰਸ ਨੂੰ ਸਥਾਪਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਮੈਨਨੀਟੋਲ ਅਤੇ ਵਿਟਾਮਿਨ ਸੀ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਪਰ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਲੇਬਲਿੰਗ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਨਹੀਂ ਪਾਇਆ ਗਿਆ।H2O2 ਦੇ ਜੋੜ, ਪਰ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਨਹੀਂ, ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਨਹੀਂ ਹੋਇਆ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3a)।Si-DMA ਪੜਤਾਲਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਇਮੇਜਿੰਗ ਨੇ HEK293T-miniSOG ਤਾਰ ਵਿੱਚ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ, ਪਰ ਅਸਲ HEK293T ਤਾਰ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਮਾਈਟੋਸੌਕਸ ਰੈੱਡ ਰੋਸ਼ਨੀ (ਚਿੱਤਰ 1e ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3b) 30 ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੁਪਰਆਕਸਾਈਡ ਉਤਪਾਦਨ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾ ਸਕਿਆ। ਇਹ ਅੰਕੜੇ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਬਾਅਦ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਲੇਬਲਿੰਗ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਮੁੱਖ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਆਕਸੀਜਨ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਹੈ।ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਦੀ ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਟੀ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਕਿਰਨ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚਾਂ ਸਮੇਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਟੀ ਨਹੀਂ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4a)।
ਲੇਬਲਿੰਗ ਵਿਧੀ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਅਤੇ LC-MS/MS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਪਛਾਣ ਨੂੰ ਸਮਰੱਥ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਸਾਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕਿਹੜੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਨੂੰ ਸੋਧਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਜਾਂਚ ਲੇਬਲਾਂ ਦਾ ਡੈਲਟਾ ਪੁੰਜ।ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ, ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ, ਟ੍ਰਿਪਟੋਫੈਨ ਅਤੇ ਟਾਈਰੋਸਿਨ ਨੂੰ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ 14,15 ਦੁਆਰਾ ਸੋਧਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਅਸੀਂ MSFragger32 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ FragPipe ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੀ ਨਿਰਪੱਖ ਓਪਨ ਖੋਜ ਦੇ ਨਾਲ TOP-ABPP31 ਵਰਕਫਲੋ ਨੂੰ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਸੋਧ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚ ਲੇਬਲਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਕਲਿਕ ਕੈਮਿਸਟਰੀ ਨੂੰ ਇੱਕ ਕਲੀਵੇਬਲ ਲਿੰਕਰ ਵਾਲੇ ਬਾਇਓਟਿਨ ਰਿਡਕਸ਼ਨ ਲੇਬਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਨਿਊਟਰਾਵਿਡਿਨ ਸਟਰੈਚਿੰਗ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਪਾਚਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਸੋਧਿਆ ਹੋਇਆ ਪੈਪਟਾਇਡ, ਅਜੇ ਵੀ ਰਾਲ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ, ਨੂੰ LC-MS/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਚਿੱਤਰ 2a ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਡੇਟਾ 1) ਲਈ ਫੋਟੋਕਲੀਵ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੂਚੀਬੱਧ ਕੀਤੇ 50 ਪੇਪਟਾਇਡ ਮੈਪ (PSM) ਮੈਚਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਵਿੱਚ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਸੋਧਾਂ ਹੋਈਆਂ (ਚਿੱਤਰ 2b)।ਹੈਰਾਨੀ ਦੀ ਗੱਲ ਹੈ ਕਿ, ਅਸੀਂ ਸਿਰਫ ਹਿਸਟੀਡਾਈਨ ਦੀ ਸੋਧ ਵੇਖੀ ਹੈ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੋਰ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਾਂ ਨਾਲੋਂ ਐਨੀਲਿਨ ਜਾਂਚਾਂ ਪ੍ਰਤੀ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ਡ ਹਿਸਟੀਡਾਈਨ ਦੀ ਉੱਚ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਦੇ ਕਾਰਨ।ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੁਆਰਾ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਆਕਸੀਕਰਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਵਿਧੀ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, +229 Da ਦਾ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਡੈਲਟਾ-ਮਾਸ ਬਣਤਰ ਦੋ ਆਕਸੀਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 2-ਆਕਸੋ-ਹਿਸਟੀਡੀਨ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਬ 3 ਦੇ ਜੋੜ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ +247 Da ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਿਸਿਸ ਉਤਪਾਦ ਹੈ। of +229 Da (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5)।MS2 ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਦੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਨੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ y ਅਤੇ b ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਦੀ ਉੱਚ ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ ਦਿਖਾਈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਟੁਕੜੇ ਆਇਨਾਂ (y ਅਤੇ b) (Fig. 2c) ਦੀ ਪਛਾਣ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।PDPL-ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨਜ਼ ਦੇ ਸਥਾਨਕ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਸੰਦਰਭ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ±1 ਸਥਿਤੀਆਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4b) 'ਤੇ ਛੋਟੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਲਈ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਮੋਟਿਫ ਤਰਜੀਹ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਔਸਤਨ, 1.4 ਹਿਸਟੀਡਾਈਨ ਪ੍ਰਤੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਹਨਾਂ ਮਾਰਕਰਾਂ ਦੀਆਂ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਘੋਲਨਸ਼ੀਲ ਪਹੁੰਚਯੋਗ ਸਤਹ ਖੇਤਰ (SASA) ਅਤੇ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਘੋਲਨਸ਼ੀਲ ਉਪਲਬਧਤਾ (RSA) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4c,d) ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
MSFragger ਦੁਆਰਾ ਸੰਚਾਲਿਤ FragPipe ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬਕਾਇਆ ਚੋਣ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਨਿਰਪੱਖ ਵਰਕਫਲੋ।ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਰਾਲ ਤੋਂ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਫੋਟੋਕਲੀਵੇਜ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦੇਣ ਲਈ ਕਲਿਕ ਕੈਮਿਸਟਰੀ ਵਿੱਚ ਕਲੀਵੇਬਲ ਲਿੰਕਰ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਕਈ ਸੋਧਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਖੁੱਲ੍ਹੀ ਖੋਜ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।b ਪੂਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਵਿੱਚ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਸੋਧਾਂ ਦੇ ਪੁੰਜ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ।ਪੇਪਟਾਇਡ ਮੈਪਿੰਗ PSM.c MS2 ਜਾਂਚ 3 ਨਾਲ ਸੋਧੀਆਂ ਗਈਆਂ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਐਨੋਟੇਸ਼ਨ। ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧ ਉਦਾਹਰਨ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪ੍ਰੋਬ 3 ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਹਿ-ਸਹਿਯੋਗੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੇ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ +229.0938 Da ਜੋੜਿਆ।d ਪਰਿਵਰਤਨ ਅਸੈਸ PDPL ਮਾਰਕਰਾਂ ਲਈ ਟੈਸਟ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।PRDX3 (H155A, H225A) ਅਤੇ PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ਨੂੰ ਐਂਟੀ-ਫਲੈਗ ਖੋਜ ਲਈ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡਾਂ ਨਾਲ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।e ਜਾਂਚ 3 ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ Δm +247 ਅਤੇ +229 ਦੇ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ LC-MS ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਨੋਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।f miniSOG-6xHis-tag ਅਤੇ anti-6xHis ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੇ ਨਾਲ ਮਾਡਲ ਕੀਤੇ ਵਿਟਰੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਤੋਂ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ।ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਆਉਣ ਦੇ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਿਆਂ, ਪ੍ਰੋਬ 3 ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ miniSOG-6xHis/anti-6xHis ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦਾ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਨ (ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਐਚਆਰਪੀ) ਅਤੇ ਐਂਟੀ-ਮਾਊਸ ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ।ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਲੇਬਲ ਅਨੁਸਾਰੀ ਅਣੂ ਭਾਰ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਹਨ: LC ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਲਾਈਟ ਚੇਨ, HC ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਹੈਵੀ ਚੇਨ।ਇਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਏ ਗਏ ਸਨ।
ਲੇਬਲਿੰਗ ਸਾਈਟ ਦੀ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਤਸਦੀਕ ਲਈ, ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ PRDX3 ਅਤੇ PRDX1 ਨੂੰ ਹਿਸਟੀਡਾਈਨ ਤੋਂ ਅਲਾਨਾਈਨ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਅਸੈਸ ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।PDPL ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੇ ਲੇਬਲਿੰਗ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 2d).ਇਸ ਦੌਰਾਨ, ਓਪਨ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਬ 3 ਅਤੇ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ੁੱਧ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਦੋਂ LC-MS ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ +247 ਅਤੇ +229 Da ਦੀ ਪੁੰਜ ਸ਼ਿਫਟ ਦੇ ਨਾਲ ਉਤਪਾਦ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਸਨ। . 2e).).ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ miniSOG ਫੋਟੋਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਪਰੋਸੀਮਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ miniSOG-6xHis ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਐਂਟੀ-ਹਿਜ਼ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਚਿੱਤਰ 2f) ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ ਨਕਲੀ ਨੇੜਤਾ ਪਰਖ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਇਸ ਪਰਖ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਦੇ ਨਾਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਹੈਵੀ ਅਤੇ ਲਾਈਟ ਚੇਨਜ਼ ਦੇ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਸੀ।ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, ਐਂਟੀ-ਮਾਊਸ (ਐਂਟੀ-6xHis-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀਆਂ ਭਾਰੀ ਅਤੇ ਹਲਕੇ ਚੇਨਾਂ ਨੂੰ ਪਛਾਣਨਾ) ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟਸ ਨੇ ਭਾਰੀ ਅਤੇ ਹਲਕੇ ਚੇਨਾਂ ਦੇ ਮਜ਼ਬੂਤ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਦਿਖਾਇਆ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ 6xHis ਟੈਗ ਅਤੇ ਲਾਈਟ ਅਤੇ ਹੈਵੀ ਚੇਨਜ਼ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਸ ਦੇ ਕਾਰਨ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਆਟੋਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਲਾਈਸਿਨ ਅਤੇ 2-ਆਕਸੋ-ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਪ੍ਰੌਕਸੀਮਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਪਾੜੇ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸਿੱਟਾ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਨੇੜਤਾ-ਨਿਰਭਰ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਨੂੰ ਸੋਧਿਆ ਹੈ।
ਸਾਡਾ ਅਗਲਾ ਟੀਚਾ ਸੀਟੂ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਕਰਨਾ ਸੀ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਨਿਊਕਲੀਅਸ, ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਮੈਟਰਿਕਸ, ਜਾਂ HEK293T ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3a) ਦੇ ਬਾਹਰੀ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ miniSOG ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਜੈੱਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਤਿੰਨ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਸਥਾਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਲੇਬਲਿੰਗ ਪੈਟਰਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3b) 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਬੈਂਡਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਇਮੇਜਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਪੀਡੀਪੀਐਲ (ਚਿੱਤਰ 3 ਸੀ) ਦੀ ਉੱਚ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਿਖਾਈ ਹੈ।ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਵਰਕਫਲੋ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਜ਼ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਰੋਡਾਮਾਇਨ ਰੰਗਾਂ ਨਾਲ ਕਲਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪਾਲਣਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਸਿਗਨਲਾਂ ਨੂੰ ਡੀਏਪੀਆਈ, ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਟ੍ਰੈਕਰਸ, ਜਾਂ ਈਆਰ ਟ੍ਰੈਕਰਸ ਨਾਲ ਸਮੂਹਿਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਦੀ ਉੱਚ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੇ ਹੋਏ।ਤਿੰਨ ਆਰਗੇਨੇਲ ਟਿਕਾਣਿਆਂ ਲਈ, ਏਵੀਡਿਨ ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਟਰਬੋਆਈਡੀ ਦੇ ਨਾਲ PDPL ਦੀ ਇੱਕ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ PDPL ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।PDPL ਹਾਲਤਾਂ ਦੇ ਤਹਿਤ, ਵਧੇਰੇ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਬੈਂਡ ਦਿਖਾਈ ਦਿੱਤੇ, ਜੋ ਕਿ ਵਧੇਰੇ PDPL-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6a-d) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
miniSOG-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੇ organelle-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਇੱਕ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ।miniSOG ਮਨੁੱਖੀ COX4 (mito-miniSOG) ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ 23 ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਾਂ ਨੂੰ ਫਿਊਜ਼ਨ ਰਾਹੀਂ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਨੂੰ ਫਿਊਜ਼ਨ ਰਾਹੀਂ H2B (ਨਿਊਕਲੀਅਸ-ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ), ਅਤੇ ER ਝਿੱਲੀ (ER-miniSOG) ਦੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਪਾਸੇ ਰਾਹੀਂ Sec61β ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ। ).ਸੰਕੇਤਾਂ ਵਿੱਚ ਜੈੱਲ ਇਮੇਜਿੰਗ, ਕਨਫੋਕਲ ਇਮੇਜਿੰਗ, ਅਤੇ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।b ਤਿੰਨ ਆਰਗੇਨੇਲ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ PDPL ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਜੈੱਲ ਚਿੱਤਰ।CBB Coomassie ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਨੀਲਾ।c HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧ ਕਨਫੋਕਲ ਚਿੱਤਰ ਜੋ ਕਿ V5 (ਲਾਲ) ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜੇ ਗਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਉਪ-ਸੈਲੂਲਰ ਸਥਾਨੀਕਰਨ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿੰਨੀਐਸਓਜੀ ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਮਾਰਕਰ ਮਾਈਟੋਕਾਂਡਰੀਆ ਅਤੇ ਈਆਰ (ਹਰੇ) ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।PDPL ਵਰਕਫਲੋ ਵਿੱਚ Cy3-azide ਕਲਿੱਕ ਕੈਮਿਸਟਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ miniSOG (ਪੀਲੇ) ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦੀ ਖੋਜ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।ਸਕੇਲ ਬਾਰ: 10 µm।d ਵੱਖ-ਵੱਖ ਅੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪੀਡੀਪੀਐਲ-ਟੈਗਡ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਜ਼ ਦੇ ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਰਹਿਤ ਮਾਤਰਾ (n = 3 ਸੁਤੰਤਰ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ) ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਦੇ ਹਨ।ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦਾ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟਾਂ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।HEK293T ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ ਨੂੰ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ>2-ਗੁਣਾ ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ ਅੰਤਰ)। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ>2-ਗੁਣਾ ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ ਅੰਤਰ)। Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ> ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ ਵਿੱਚ 2-ਗੁਣਾ ਅੰਤਰ)।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ > ਆਇਓਨਿਕ ਤਾਕਤ ਵਿੱਚ 2-ਗੁਣਾ ਅੰਤਰ)।ਸੰਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ HEK293T-miniSOG ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹਨ ਪਰ HEK293T ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹਨ ਨੂੰ ਹਰੇ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।e ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਡੇਟਾਸੈਟਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ d.ਹਰੇਕ ਅੰਗ (ਲਾਲ ਅਤੇ ਹਰੇ ਬਿੰਦੀਆਂ) ਵਿੱਚ ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ ਸੰਖਿਆ ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਹਿਸਟੋਗ੍ਰਾਮ ਮੀਟੋਕਾਰਟਾ 3.0, ਜੀਓ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਏ. ਟਿੰਗ ਐਟ ਅਲ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਆਰਗੇਨੇਲਜ਼ ਵਿੱਚ ਸਥਾਨਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਲੋਕ।ਮਾਈਟੋਕਾਂਡਰੀਆ, ਨਿਊਕਲੀਅਸ, ਅਤੇ ER ਲਈ ਵੱਖਰੇ ਡੇਟਾਸੈਟ।ਇਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਏ ਗਏ ਸਨ।ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਜੈੱਲ ਅਤੇ ਇਮੇਜਿੰਗ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ, ਲੇਬਲ-ਮੁਕਤ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਹਰੇਕ ਅੰਗ (ਪੂਰਕ ਡੇਟਾ 2) ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਮਾਰਕਰਾਂ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਅਣ-ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਟਡ HEK293T ਨੂੰ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ > 2-ਫੋਲਡ ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ) ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਸਿੰਗਲਟਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤੇ ਜੋ ਸਿਰਫ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ-ਐਕਸਪ੍ਰੈਸਿੰਗ ਲਾਈਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3d ਲਾਲ ਅਤੇ ਹਰੇ ਬਿੰਦੀਆਂ) ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹਨ। ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ > 2-ਫੋਲਡ ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ) ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਸਿੰਗਲਟਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤੇ ਜੋ ਸਿਰਫ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ-ਐਕਸਪ੍ਰੈਸਿੰਗ ਲਾਈਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3d ਲਾਲ ਅਤੇ ਹਰੇ ਬਿੰਦੀਆਂ) ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹਨ। Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (p<0.05 ਅਤੇ >2-ਫੋਲਡ ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ) ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਸਿੰਗਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਿਖਾਏ ਜੋ ਸਿਰਫ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ-ਐਕਸਪ੍ਰੈਸਿੰਗ ਲਾਈਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3d, ਲਾਲ ਅਤੇ ਹਰੇ ਬਿੰਦੀਆਂ) ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹਨ।火火 图 分析 出 出 显着 显着 富集 富集 富集 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 0.05 和> 2 在于 在于 强度 强度 单) 以及 仅 存 在于 ਮਿਨੀਸੌਗ 表达 图 3D 红色 和 绿色点 和 和 和 绿色点).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ Гулкана вывильойые Таннная Сильные тонии ਮਿਨੀਸੋਗ, пishы и зеленые Тоннная синной такаже о >ые Точки на ис. 3 ਡੀ). ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (p<0.05 ਅਤੇ >2x ionic ਤਾਕਤ) ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਸਿਰਫ miniSOG ਸਮੀਕਰਨ ਲਾਈਨ (ਚਿੱਤਰ 3d ਵਿੱਚ ਲਾਲ ਅਤੇ ਹਰੇ ਬਿੰਦੀਆਂ) ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਸਿੰਗਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਇਹਨਾਂ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਅਸੀਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 1364, 461, ਅਤੇ 911 ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਮਾਣੂ, ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ, ਅਤੇ ER ਬਾਹਰੀ ਝਿੱਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ।ਆਰਗੇਨੇਲ-ਸਥਾਨਕ PDPL ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ MitoCarta 3.0, ਜੀਨ ਓਨਟੋਲੋਜੀ (GO) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਅਤੇ A. Ting et al ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।73.4, 78.5, ਅਤੇ 73.0% (ਚਿੱਤਰ 3e) ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ, ਖੋਜੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀ ਆਰਗੇਨੇਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਮਾਈਟੋਕਾਂਡਰੀਆ, ਨਿਊਕਲੀਅਸ, ਅਤੇ ER ਲਈ ਇੱਕ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ8 ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।PDPL ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਇਸ ਗੱਲ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੀ ਹੈ ਕਿ PDPL ਆਰਗੇਨੇਲ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਆਦਰਸ਼ ਸਾਧਨ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਸਬਮਿਟੋਚੌਂਡਰੀਅਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਫਸੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਨੂੰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਝਿੱਲੀ (ਕ੍ਰਮਵਾਰ 226 ਅਤੇ 106) ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ ਸੰਖਿਆ ਦਾ 91.7% (362) ਹੈ।PDPL ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰ ਦੀ ਵੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7a)।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਸਬਨਿਊਕਲੀਅਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਕੈਪਚਰ ਕੀਤਾ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ, ਨਿਊਕਲੀਓਪਲਾਜ਼ਮ, ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਓਲਸ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7b) ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਲੋਕਾਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਸਿਗਨਲ ਪੈਪਟਾਇਡ (3xNLS) ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ H2B ਨਿਰਮਾਣ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7c–h) ਦੇ ਸਮਾਨ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦਿਖਾਈ।PDPL ਮਾਰਕਰ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਪਰਮਾਣੂ ਲੈਮਿਨਿਨ ਏ ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਵਿਵੇਕਿਤ ਸਥਾਨਿਕ POI7 ਜਾਲ ਵਜੋਂ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।PDPL ਨੇ 36 ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ 12 ਪ੍ਰੋਟੀਨ (30.0% ਲੈਮਿਨ ਏ ਸਮੇਤ) ਸਟ੍ਰਿੰਗ ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੁਆਰਾ ਐਨੋਟੇਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਲੇਮਿਨ ਏ ਇੰਟਰੈਕਟਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਾਲੇ ਸਨ, 28 ਵਿੱਚੋਂ 28, 22.9 ਬਾਇਓਆਈਡੀ ਵਿਧੀ (122 ਪ੍ਰੋਟੀਨ) ਨਾਲੋਂ ਉੱਚ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਦੇ ਨਾਲ। %) 7. ਸਾਡੀ ਵਿਧੀ ਨੇ ਘੱਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੀਮਤ ਲੇਬਲਿੰਗ ਖੇਤਰਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਜੋ ਕਿ ਵਧੇਰੇ ਸਰਗਰਮ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੁਆਰਾ ਸੰਭਵ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।GO ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਊਕਲੀਓਪਲਾਜ਼ਮ (26), ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਝਿੱਲੀ (10), ਪਰਮਾਣੂ ਝਿੱਲੀ (9), ਅਤੇ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਪੋਰਸ (5) ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਸਨ।ਸਮੂਹਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਪਰਮਾਣੂ-ਸਥਾਨਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 80% ਅਮੀਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਹਨ, ਜੋ ਅੱਗੇ PDPL (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8a–d) ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
ਆਰਗੇਨੇਲਜ਼ ਵਿੱਚ ਨੇੜਤਾ ਮਾਰਕ ਕਰਨ ਲਈ PDPL ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਸਥਾਪਿਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਕਿ ਕੀ PDPL ਦੀ ਵਰਤੋਂ POI ਬਾਈਡਿੰਗ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਸਾਈਟੋਸੋਲਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ PDPL ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕੀਤੀ, ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਬਹੁਤ ਹੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਸੁਭਾਅ ਦੇ ਕਾਰਨ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਝਿੱਲੀ-ਸਥਾਨਕ ਹਮਰੁਤਬਾ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਮੁਸ਼ਕਲ ਟੀਚੇ ਮੰਨੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਬ੍ਰੋਮੋਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਐਕਸਟਰਾਟਰਮਿਨਲ (BET) ਪ੍ਰੋਟੀਨ BRD4 ਨੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਬਿਮਾਰੀਆਂ 35, 36 ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਮੁੱਖ ਭੂਮਿਕਾ ਲਈ ਸਾਡਾ ਧਿਆਨ ਖਿੱਚਿਆ ਹੈ।BRD4 ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਕੰਪਲੈਕਸ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਕੋਐਕਟੀਵੇਟਰ ਅਤੇ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਇਲਾਜ ਦਾ ਟੀਚਾ ਹੈ।c-myc ਅਤੇ Wnt5a ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਾਰਕਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਕੇ, BRD4 ਨੂੰ ਤੀਬਰ ਮਾਈਲੋਇਡ ਲਿਊਕੇਮੀਆ (ਏਐਮਐਲ), ਮਲਟੀਪਲ ਮਾਈਲੋਮਾ, ਬੁਰਕਿਟਜ਼ ਲਿਮਫੋਮਾ, ਕੋਲਨ ਕੈਂਸਰ ਅਤੇ ਸੋਜਸ਼ ਦੀਆਂ ਬਿਮਾਰੀਆਂ 37,38 ਦਾ ਮੁੱਖ ਨਿਰਣਾਇਕ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਕੁਝ ਵਾਇਰਸ ਵਾਇਰਲ ਅਤੇ ਸੈਲੂਲਰ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਨਿਯਮਤ ਕਰਨ ਲਈ BRD4 ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੈਪਿਲੋਮਾਵਾਇਰਸ, HIV, ਅਤੇ SARS-CoV-236,39।
PDPL ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ BRD4 ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਮੈਪ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ BRD4 ਦੇ ਇੱਕ ਛੋਟੇ N- ਜਾਂ C-ਟਰਮੀਨਲ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਨਾਲ miniSOG ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦੋ ਨਿਰਮਾਣਾਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 9a) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਉੱਚ ਪੱਧਰੀ ਓਵਰਲੈਪ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।miniSOG-H2B ਨਾਲ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ BRD4 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 9b) ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਣ ਵਾਲੇ 77.6% ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਕਵਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਫਿਰ, ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ (2, 5, 10, 20 ਮਿੰਟ) ਮਾਰਕਰ ਦੇ ਘੇਰੇ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 4a ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਡੇਟਾ 3)।ਅਸੀਂ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਛੋਟੇ ਫੋਟੋਪੀਰੀਅਡਾਂ 'ਤੇ, PDPL ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਿੱਧੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਹਿੱਸੇਦਾਰਾਂ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕਰੇਗਾ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਫੋਟੋਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਪੀਰੀਅਡਾਂ ਦੌਰਾਨ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਲੇਬਲਿੰਗ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਅਸਿੱਧੇ ਟੀਚੇ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣਗੇ।ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਨੇੜਲੇ ਸਮਾਂ ਬਿੰਦੂਆਂ (2 ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 84.6%; 5 ਅਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 87.7%; 10 ਅਤੇ 20 ਮਿੰਟ ਲਈ 98.7%) (ਚਿੱਤਰ 4b ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 9c) ਵਿਚਕਾਰ ਮਜ਼ਬੂਤ ਓਵਰਲੈਪ ਪਾਇਆ।ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹਾਂ ਵਿੱਚ, ਸਾਨੂੰ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ BRD4 ਸਵੈ-ਲੇਬਲਿੰਗ, ਬਲਕਿ ਕਈ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਟੀਚੇ ਜਿਵੇਂ ਕਿ MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ਅਤੇ HMGB1 ਸਟ੍ਰਿੰਗ ਡੇਟਾਬੇਸ ਵਿੱਚ ਐਨੋਟੇਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਆਇਓਨਿਕ ਤਾਕਤ ਐਕਸਪੋਜਰ ਟਾਈਮ (ਚਿੱਤਰ 4c ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 9d) ਦੇ ਅਨੁਪਾਤੀ ਹੈ।2-ਮਿੰਟ ਦੇ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਜੀਓ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਸਥਾਨਿਕ ਸਨ ਅਤੇ ਕ੍ਰੋਮੈਟਿਨ ਰੀਮਡਲਿੰਗ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਫੰਕਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਅਣੂ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਕ੍ਰੋਮੈਟਿਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਜਾਂ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਕੋਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, BRD4 ਫੰਕਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 4d) ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ।ਸਟ੍ਰਿੰਗ ਡਾਟਾਬੇਸ-ਸਮਰੱਥ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ BRD4 ਅਤੇ HDAC ਪਰਿਵਾਰ ਦੇ ਇੰਟਰੈਕਟਿੰਗ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ SIN3A, NCOR2, BCOR, ਅਤੇ SAP130 (Fig. 4e ਅਤੇ ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ Fig. 9e) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਅਸਿੱਧੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਇੱਕ ਪਹਿਲਾ ਪੱਧਰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ, BRD4 ਅਤੇ HDAC ਬਾਈਡਿੰਗ ਐਸੀਟੋਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ। ..ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, LC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਟੀਚਿਆਂ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ Sin3A, NSUN2, Fus, ਅਤੇ SFPQ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਦੀ ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ (ਚਿੱਤਰ 4f) ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, BRD4 ਦੇ ਛੋਟੇ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਨੂੰ ਤਰਲ-ਤਰਲ ਪੜਾਅ ਵਿਭਾਜਨ (LLPS) ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਨਿਊਕਲੀ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ Fus ਅਤੇ SFPQ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੇ LLPS ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇੱਥੇ ਗੈਰ-ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ BRD4 ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਹਨ।BRD4 ਅਤੇ SFPQ ਵਿਚਕਾਰ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੋ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ (ਕੋ-ਆਈਪੀ) ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4g) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ BRD4-ਵਿਚੋਲੇ ਤਰਲ-ਤਰਲ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਹੋਰ ਵਿਧੀ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਅੱਗੇ ਜਾਂਚ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ PDPL ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ BRD4 ਇੰਟਰੈਕਟਿੰਗ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਅਣਜਾਣ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਆਦਰਸ਼ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਹੈ।
miniSOG-ਵਿਚੋਲੇ BRD4 ਨੇੜਤਾ ਮਾਰਕ, ਐਕਸਪੋਜਰ ਟਾਈਮ: 2, 5, 10, ਅਤੇ 20 ਮਿੰਟ ਦੀ ਇੱਕ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ।b ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੋਸ਼ਨੀ ਸਮਿਆਂ 'ਤੇ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦਾ ਓਵਰਲੈਪ।HEK293T-miniSOG-BRD4 ਵਿੱਚ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ HEK293T ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੀ।c ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਐਕਸਪੋਜਰ ਸਮੇਂ ਦੌਰਾਨ ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ BRD4-ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਆਇਨ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ।n = 3 ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਨਮੂਨੇ।ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਵਜੋਂ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।d 2-ਮਿੰਟ ਦੇ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਜੀਨ ਔਨਟੋਲੋਜੀਕਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (GO)।ਪਹਿਲੇ ਦਸ ਜੀਓ ਸ਼ਰਤਾਂ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ।GO ਸ਼ਬਦ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਬੁਲਬੁਲੇ ਰੰਗੀਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਬੁਲਬੁਲੇ ਦਾ ਆਕਾਰ ਹਰੇਕ ਮਿਆਦ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।e BRD4 ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਸਟ੍ਰਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ।ਪੀਲੇ ਚੱਕਰ ਸਿੱਧੇ ਗੂੰਦ ਹਨ ਅਤੇ ਸਲੇਟੀ ਚੱਕਰ ਅਸਿੱਧੇ ਗੂੰਦ ਦੀ ਪਹਿਲੀ ਪਰਤ ਹਨ।ਲਾਲ ਲਾਈਨਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਨੀਲੀਆਂ ਲਾਈਨਾਂ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।f LC-MS/MS ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ BRD4 ਬਾਈਡਿੰਗ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।g ਕੋ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗ SFPQ ਅਤੇ BRD4 ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਏ ਗਏ ਸਨ।ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਗੈਰ-ਰਜਿਸਟਰਡ POI-ਸਬੰਧਤ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ PDPL ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਲਈ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੋਵੇਗਾ, ਜਿਸ ਲਈ ਗੈਰ-ਰਜਿਸਟਰਡ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰਨ ਲਈ ਵੱਡੇ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਅਸਿੱਧੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋਵੇਗੀ।ਪਾਰਕਿਨ (PARK2 ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਇੱਕ E3 ligase ਹੈ ਅਤੇ ਪਾਰਕਿਨ ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ ਆਟੋਸੋਮਲ ਰੀਸੈਸਿਵ ਕਿਸ਼ੋਰ ਪਾਰਕਿੰਸਨ'ਸ ਰੋਗ (AR-JP)42 ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪਾਰਕਿਨ ਨੂੰ ਮਾਈਟੋਫੈਜੀ (ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਆਟੋਫੈਜੀ) ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਆਕਸੀਜਨ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਕਈ ਪਾਰਕਿਨ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਇਸ ਬਿਮਾਰੀ ਵਿੱਚ ਪਾਰਕਿਨ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਅਸਪਸ਼ਟ ਹੈ।ਇਸਦੇ ਗੈਰ-ਚਰਿੱਤਰ ਰਹਿਤ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰਨ ਲਈ, PDPL ਨੂੰ ਪਾਰਕਿਨ ਦੇ N- ਜਾਂ C-ਟਰਮਿਨਸ ਵਿੱਚ miniSOG ਜੋੜ ਕੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।PINK1-ਪਾਰਕਿਨ ਮਾਰਗ ਰਾਹੀਂ ਪਾਰਕਿਨ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਕਾਰਬੋਨੀਲ ਸਾਇਨਾਈਡ ਪ੍ਰੋਟੋਨ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਐਮ-ਕਲੋਰੋਫੇਨਾਇਲਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ੋਨ (ਸੀਸੀਸੀਪੀ) ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਾਡੇ BRD4 PDPL ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਪਾਰਕਿਨ ਐਨ-ਟਰਮਿਨਸ ਫਿਊਜ਼ਨ ਨੇ ਟੀਚਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਸਮੂਹ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਸੀ-ਟਰਮਿਨਸ (210 ਵਿੱਚੋਂ 177) (ਚਿੱਤਰ 5a,b ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਡੇਟਾ 4) ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਕਵਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਨਤੀਜਾ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ N-ਟਰਮੀਨਲ ਟੈਗ ਪਾਰਕਿਨ 44 ਨੂੰ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਰਗਰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਹੈਰਾਨੀ ਦੀ ਗੱਲ ਹੈ ਕਿ, ਪਾਰਕਿਨ 43 ਲਈ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ AP-MS ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ 18 ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਨ, ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ ਤੇ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਰਕਫਲੋ ਦੇ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਦੇ ਕਾਰਨ।ਚਾਰ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ਅਤੇ PSMC3) ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਦੋ ਤਰੀਕਿਆਂ (Fig. 5c) 43 ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਹਨ।LC-MS/MS ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਹੋਰ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕਰਨ ਲਈ, PDPL ਇਲਾਜ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ HEK293T ਪੇਰੈਂਟ ਸੈੱਲ ਅਸੈਸ ਅਤੇ ਸਥਿਰ ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਪਾਰਕਿਨ ਲਾਈਨ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪਹਿਲਾਂ ਅਣਜਾਣ ਟੀਚੇ CDK2, DUT, CTBP1, ਅਤੇ PSMC4 ਨੂੰ ਇੱਕ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਬਾਈਂਡਰ, DNAJB1 (ਚਿੱਤਰ 5d) ਨਾਲ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਰਕਿਨ-ਇੰਟਰੈਕਟਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਪਾਰਕਿਨ ਦੇ N- ਜਾਂ C-ਟਰਮਿਨਸ (n = 3 ਸੁਤੰਤਰ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ) ਵਿੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦਾ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟਾਂ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।HEK293T ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ>2-ਗੁਣਾ ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ ਅੰਤਰ)। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ>2-ਗੁਣਾ ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ ਅੰਤਰ)। Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ> ਆਇਨ ਤੀਬਰਤਾ ਵਿੱਚ 2-ਗੁਣਾ ਅੰਤਰ)।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਪੀ <0.05 ਅਤੇ > ਆਇਓਨਿਕ ਤਾਕਤ ਵਿੱਚ 2-ਗੁਣਾ ਅੰਤਰ)।ਸੰਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ HEK293T-miniSOG ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹਨ ਪਰ HEK293T ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹਨ ਨੂੰ ਹਰੇ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।b ਵੇਨ ਡਾਇਗ੍ਰਾਮ N-ਟਰਮੀਨਲ ਅਤੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਕੰਸਟਰੱਕਟਸ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਿਖਾ ਰਿਹਾ ਹੈ।ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਟੈਗ ਪਾਰਕਿਨ ਨੂੰ ਅਚਨਚੇਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਰਗਰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਵਧੇਰੇ ਪਛਾਣਨ ਯੋਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣ ਸਕਦੇ ਹਨ।c ਵੇਨ ਚਿੱਤਰ PDPL ਅਤੇ AP-MS ਵਿਚਕਾਰ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਿਖਾ ਰਿਹਾ ਹੈ।ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਇੰਟਰੈਕਟਰਾਂ ਨੂੰ ਸੂਚੀਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ PDPL ਵਿੱਚ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਛਾਣੇ ਗਏ 18 ਵਿੱਚੋਂ 4 ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ 159 ਵਿੱਚੋਂ 11 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।d LC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।e Ssu72 ਅਤੇ SNW1 ਦੀ ਪਛਾਣ ਗੈਰ-ਰਜਿਸਟਰਡ ਪਾਰਕਿਨ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਹ ਫਲੈਗ-ਟੈਗਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡਾਂ ਨੂੰ HEK293T ਅਤੇ HEK293T-ਪਾਰਕਿਨ-ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ CCCP ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪਾਰਕਿਨ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਲਾਈਨ ਵਿੱਚ ਪਤਨ ਵਧੇਰੇ ਉਚਾਰਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।f ਪ੍ਰੋਟੀਸੋਮ ਇਨਿਹਿਬਟਰ MG132 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਕਿ Ssu72 ਅਤੇ SNW1 ਦੀ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਪ੍ਰੋਟੀਸੋਮ-ਯੂਬੀਕਿਟੀਨੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਏ ਗਏ ਸਨ।ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, PDPL ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਰਕਿਨ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਬਸਟਰੇਟ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ।ਗੈਰ-ਰਜਿਸਟਰਡ ਪਾਰਕਿਨ ਸਬਸਟਰੇਟਸ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਆਮ HEK293T ਤੱਕ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਲਈ ਸੱਤ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ਅਤੇ SNW1) ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਟਡ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ-ਪਾਰਕਿਨ ਦੇ 2933 ਇਲਾਜ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੀ ਗਈ।Ssu72 ਅਤੇ SNW1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ-ਪਾਰਕਿਨ ਲਾਈਨ (ਚਿੱਤਰ 5e) ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।12 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ CCCP ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਦੋਵਾਂ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦਾ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਗਿਰਾਵਟ ਹੋਇਆ।ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ Ssu72 ਅਤੇ SNW1 ਦੇ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਸੋਮ-ਯੂਬੀਕਿਟੀਨੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪ੍ਰੋਟੀਸੋਮ ਇਨਿਹਿਬਟਰ MG132 ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਸੋਮ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 5f).ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 10) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪਾਰਕਿਨ ਇੰਟਰੈਕਟਰਾਂ ਵਜੋਂ ਅਤਿਰਿਕਤ ਗੈਰ-ਸਬਸਟਰੇਟ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸ ਨੇ LC-MS/MS ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਨਤੀਜੇ ਦਿਖਾਏ ਸਨ।ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਟੀਚਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਤਸਦੀਕ ਦੇ ਨਾਲ PDPL ਵਰਕਫਲੋ ਦਾ ਏਕੀਕਰਣ ਗੈਰ-ਰਜਿਸਟਰਡ E3 ligase ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਸਾਂਝਾ ਨੇੜਤਾ ਨਿਸ਼ਾਨੀ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਪੇਸ ਅਤੇ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਇੰਟਰੈਕਟਿੰਗ POI ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਪਲੇਟਫਾਰਮ miniSOG ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸਿਰਫ 12 kDa ਹੈ, ਪਰਿਪੱਕ APEX2 ਐਨਜ਼ਾਈਮ (27 kDa) ਦੇ ਅੱਧੇ ਤੋਂ ਵੀ ਘੱਟ ਅਤੇ TurboID (35 kDa) ਦੇ ਇੱਕ ਤਿਹਾਈ ਆਕਾਰ ਦਾ ਹੈ।ਛੋਟੇ ਆਕਾਰ ਨੂੰ ਛੋਟੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰਐਕਟੋਮ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਰੇਂਜ ਦਾ ਬਹੁਤ ਵਿਸਤਾਰ ਕਰਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦੀ ਕੁਆਂਟਮ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਅਤੇ ਇਸ ਪਹੁੰਚ ਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ, ਵਾਧੂ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰਾਂ ਦੀ ਹੋਰ ਖੋਜ, ਭਾਵੇਂ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਾਂ ਛੋਟੇ ਅਣੂ ਹੋਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।miniSOG ਦੇ ਮੌਜੂਦਾ ਸੰਸਕਰਣ ਲਈ, ਨੇੜਤਾ ਮਾਰਕਰਾਂ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਨੀਲੇ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਉੱਚ ਅਸਥਾਈ ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਲੰਬੇ ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਸਮੇਂ ਨੇ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਦਾ ਇੱਕ ਵੱਡਾ "ਕਲਾਊਡ" ਜਾਰੀ ਕੀਤਾ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਵਧੇਰੇ ਦੂਰ-ਦੁਰਾਡੇ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਵਿੱਚ ਸੋਧ, ਲੇਬਲਿੰਗ ਰੇਡੀਅਸ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ, ਅਤੇ PDPL ਸਥਾਨਿਕ ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵਧੀਆ-ਟਿਊਨ ਕਰਨ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ।ਅਸੀਂ ਸਿਗਨਲ-ਟੂ-ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਸੱਤ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚਾਂ ਦੀ ਵੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਇਸ ਪਹੁੰਚ ਦੇ ਪਿੱਛੇ ਅਣੂ ਵਿਧੀ ਦੀ ਖੋਜ ਕੀਤੀ।TOP-ABPP ਵਰਕਫਲੋ ਨਿਰਪੱਖ ਖੁੱਲੀ ਖੋਜ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲ ਕੇ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸੋਧਾਂ ਸਿਰਫ ਹਿਸਟੀਡਾਈਨਜ਼ ਵਿੱਚ ਆਈਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਲੂਪ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨਜ਼ ਲਈ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਤਰਜੀਹ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ, ਵਧੇ ਹੋਏ ਹਿਸਟੀਡਾਈਨ ਸੋਧਾਂ ਲਈ ਕੋਈ ਇਕਸਾਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋ-ਵਾਤਾਵਰਣ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਕਵਰੇਜ ਦੇ ਨਾਲ ਉਪ-ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਵੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ ਜੋ ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਹੋਰ ਨੇੜਤਾ ਲੇਬਲਿੰਗ ਅਤੇ ਆਰਗੇਨੇਲ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚ ਵਿਧੀਆਂ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾਯੋਗ ਹੈ।ਨੇੜਤਾ ਮਾਰਕਰਾਂ ਦੀ ਸਤਹ, ਲਾਈਸੋਸੋਮਲ, ਅਤੇ ਸੀਕਰੇਟੋਮ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਜ਼ 46,47 ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਸਾਡਾ ਮੰਨਣਾ ਹੈ ਕਿ PDPL ਇਹਨਾਂ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਅੰਗਾਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੋਵੇਗਾ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਸਾਇਟੋਸੋਲਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਲਈ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਕੇ PDPL ਨੂੰ ਚੁਣੌਤੀ ਦਿੱਤੀ ਹੈ ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਅਤੇ ਵਧੇਰੇ ਅਸਥਾਈ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਮੂਲੀਅਤ ਦੇ ਕਾਰਨ ਝਿੱਲੀ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਹਨ।ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਨੂੰ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ, ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਕੋਐਕਟੀਵੇਟਰ BRD4 ਅਤੇ ਬਿਮਾਰੀ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਲੀਗੇਸ E3 ਪਾਰਕਿਨ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਬੁਨਿਆਦੀ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਕਾਰਜਾਂ ਲਈ ਚੁਣੇ ਗਏ ਸਨ, ਸਗੋਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਕਲੀਨਿਕਲ ਸਾਰਥਕਤਾ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਲਈ ਵੀ ਚੁਣੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਹਨਾਂ ਦੋ POI ਲਈ, ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਗੈਰ-ਰਜਿਸਟਰਡ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪੜਾਅ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨ SFPQ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਸਹਿ-IP ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਜਿਸ ਦੁਆਰਾ BRD4 (ਛੋਟਾ ਆਈਸੋਫਾਰਮ) LLPS ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਉਸੇ ਸਮੇਂ, ਅਸੀਂ ਮੰਨਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪਾਰਕਿਨ ਸਬਸਟਰੇਟਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਇੱਕ ਦ੍ਰਿਸ਼ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਸਿੱਧੇ ਚਿਪਕਣ ਵਾਲੇ ਪਦਾਰਥਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਦੋ ਅਣਪਛਾਤੇ ਪਾਰਕਿਨ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਸਰਵ-ਵਿਆਪਕ-ਪ੍ਰੋਟੀਸੋਮ ਮਾਰਗ ਦੇ ਨਾਲ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਪਤਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ।ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਲੇਜ਼ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਨੂੰ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਨਾਲ ਫਸਾ ਕੇ ਖੋਜਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਧੀ-ਅਧਾਰਤ ਟ੍ਰੈਪਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਹੈ, ਇਹ ਵੱਡੇ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਨਹੀਂ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਅਤੇ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਿਚਕਾਰ ਸਹਿ-ਸਹਿਯੋਗੀ ਬਾਂਡਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪੀਡੀਪੀਐਲ ਨੂੰ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਅਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਪਰਿਵਾਰਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਡੀਯੂਬੀਕਿਟਿਨੇਜ਼ ਅਤੇ ਮੈਟਾਲੋਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਪਰਿਵਾਰਾਂ।
ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਦਾ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਰੂਪ, ਜਿਸਨੂੰ SOPP3 ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਉਤਪਾਦਨ ਨਾਲ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਦੀ SOPP3 ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਹੈ ਅਤੇ ਬਿਹਤਰ ਮਾਰਕਿੰਗ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਪਾਇਆ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਸਿਗਨਲ-ਟੂ-ਆਵਾਜ਼ ਅਨੁਪਾਤ ਕੋਈ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਰਿਹਾ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 11)।ਅਸੀਂ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਹੈ ਕਿ SOPP3 (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਵਿਕਾਸ ਦੁਆਰਾ) ਦਾ ਅਨੁਕੂਲਨ ਵਧੇਰੇ ਕੁਸ਼ਲ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰੇਗਾ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟ ਰੋਸ਼ਨੀ ਸਮੇਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵਧੇਰੇ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਕੈਪਚਰ ਕਰਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਮਿਲਦੀ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, PDPL ਦਾ ਮੌਜੂਦਾ ਸੰਸਕਰਣ ਸੈਲੂਲਰ ਵਾਤਾਵਰਣ ਤੱਕ ਸੀਮਿਤ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਨੂੰ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਡੂੰਘੇ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦਾ।ਇਹ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਮਾਡਲ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, PDPL ਦੇ ਨਾਲ optogenetics ਦਾ ਸੁਮੇਲ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਲਈ ਇੱਕ ਮੌਕਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਹੋਰ ਇੰਜਨੀਅਰਡ ਇਨਫਰਾਰੈੱਡ ਫੋਟੋਸੈਂਸੀਟਾਈਜ਼ਰ ਵੀ ਇਸ ਸੀਮਾ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਫਿਲਹਾਲ ਇਸ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਖੋਜ ਚੱਲ ਰਹੀ ਹੈ।
HEK293T ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ATCC (CRL-3216) ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਮਾਈਕੋਪਲਾਜ਼ਮਾ ਲਾਗ ਲਈ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਟੈਸਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ 10% ਭਰੂਣ ਬੋਵਾਈਨ ਸੀਰਮ (FBS, Vistech, #SE100-B) ਅਤੇ 1% ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ/ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (ਹਾਈਕਲੋਨ, #SV3) ਨਾਲ ਪੂਰਕ DMEM (ਥਰਮੋ, #C11995500BT) ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਵਿੱਚ ਵਧਿਆ
3-ਐਮੀਨੋਫਿਨਾਇਲੀਨ (ਨਮੂਨਾ 3) ਅਤੇ (4-ਐਥੀਨਿਲਫਿਨਾਇਲ) ਮੀਥਾਮਾਈਨ (ਨਮੂਨਾ 4) ਬੀਡੇਫਾਰਮ ਤੋਂ ਖਰੀਦਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਪਾਈਲਾਮਾਈਨ (ਪ੍ਰੋਬ 2) ਊਰਜਾ-ਰਸਾਇਣਾਂ ਤੋਂ ਖਰੀਦੀ ਗਈ ਸੀ।N-(2-ਐਮੀਨੋਫੇਨਾਇਲ) ਪੈਂਟ-4-ਯਨਾਮਾਈਡ (ਪੜਤਾਲ 1) ਨੂੰ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਤਰੀਕਿਆਂ ਅਨੁਸਾਰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1 ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਜੈਨੇਟਿਕ ਨਿਰਮਾਣਾਂ ਦੀ ਸੂਚੀ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।miniSOG ਅਤੇ KillerRed ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਪੀ. ਜ਼ੂ (ਪੇਕਿੰਗ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ) ਦੇ ਤੋਹਫ਼ੇ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਤੋਂ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਟਾਰਗੇਟਿੰਗ ਕ੍ਰਮ COX4 ਦੇ 23 N-ਟਰਮੀਨਲ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਾਂ ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਗਿਬਸਨ ਅਸੈਂਬਲੀ (Beyotime, #D7010S) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੰਕੇਤ ਵੈਕਟਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਐਂਡੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੇਟੀਕੁਲਮ ਦੇ ਝਿੱਲੀ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਸੀਡੀਐਨਏ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤੋਂ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ SEC61B ਮਨੁੱਖੀ ਡੀਐਨਏ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), ਅਤੇ H2B ਡੀਐਨਏ (ਡੀ. ਲਿਨ, ਬਾਏ ਲੇਬੋਰੇਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਦਾਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਅਤੇ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ, ਜਿਵੇਂ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਹੋਰ ਸੰਕੇਤ ਨਹੀਂ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ, ਸਥਿਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਅਤੇ ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ HEK293T ਸੈੱਲ cDNA ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤੋਂ ਪੀਸੀਆਰ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।G3S (GGGS) ਅਤੇ G4S (GGGGS) ਦਾਣਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ miniSOG ਵਿਚਕਾਰ ਲਿੰਕਰ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ V5 ਐਪੀਟੋਪ ਟੈਗ (GKPIPNPLLGLDST) ਇਹਨਾਂ ਫਿਊਜ਼ਨ ਨਿਰਮਾਣਾਂ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਥਣਧਾਰੀ ਜੀਵਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਲਈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, miniSOG ਫਿਊਜ਼ਨ ਕੰਸਟਰੱਕਟ ਨੂੰ pLX304 ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਲ ਵੈਕਟਰ ਵਿੱਚ ਸਬਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਲਈ, miniSOG ਨੂੰ C-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ 6xHis ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ pET21a ਵੈਕਟਰ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਛੇ-ਖੂਹ ਵਾਲੀਆਂ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀ ਖੂਹ 2.0 x 105 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸੀਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 24 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਲੈਨਟੀਵਾਇਰਲ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ (2.4 μg pLX304) ਅਤੇ ਵਾਇਰਲ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ (1.5 μg psPAX2 ਅਤੇ 1.2 μg 1.2 μg 1.2 μg 0000 ਨਾਲ ਪੀਐਮਡੀ0000 ਟਾਈਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ) ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। , #C0533), ਲਗਭਗ 80% ਫਿਊਜ਼ਨ।ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਹੋਰ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਵਾਇਰਸ ਦਾ ਸੰਗ੍ਰਹਿ 24, 48 ਅਤੇ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਟੀਚਾ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਦੀ ਲਾਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਵਾਇਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਇੱਕ 0.8 μm ਫਿਲਟਰ (Merck, #millex-GP) ਦੁਆਰਾ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪੌਲੀਬ੍ਰੀਨ (Solarbio, #H8761) ਨੂੰ 8 μg/ml ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।24 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਬਦਲ ਕੇ ਮੁੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ.ਹੇਠਲੇ ਸਖ਼ਤ ਚੋਣ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ ਅੰਸ਼ਾਂ ਲਈ 5 μg/ml ਬਲਾਸਟੀਸੀਡੀਨ (ਸੋਲਰਬੀਓ, #3513-03-9) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਫਿਰ ਅਗਲੇ ਤਿੰਨ ਅੰਸ਼ਾਂ ਲਈ 20 μg/ml ਨੂੰ ਇੱਕ ਹੋਰ ਸਖ਼ਤ ਨਿਯਮ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ।
ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 12-ਖੂਹ ਵਾਲੇ ਚੈਂਬਰਾਂ (Ibidi, #81201) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀ ਖੂਹ ਲਗਭਗ 20,000 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਘਣਤਾ 'ਤੇ ਬੀਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।HEK293T ਕੋਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, 50 µg/ml ਫਾਈਬਰੋਨੈਕਟਿਨ (ਕੋਰਨਿੰਗ, #356008) ਨੂੰ 37°C 'ਤੇ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰਡ ਖਾਰੇ (PBS, Sangon, #B640435) ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰੋ।ਚੈਂਬਰਾਂ ਨੂੰ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰੀਟਰੀਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਫਿਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ।24 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਇੱਕ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, 1 ਐਮਐਮ ਪ੍ਰੋਬ 3 ਨਾਲ ਤਾਜ਼ੇ ਹੈਂਕਸ ਦੇ ਸੰਤੁਲਿਤ ਲੂਣ ਘੋਲ (ਐਚਬੀਐਸਐਸ, ਗਿਬਕੋ, #14025092) ਵਿੱਚ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਇੱਕ ਨੀਲੇ LED (460 nm) ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ).) ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਕਿਰਨਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਉਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਪੀਬੀਐਸ (ਸਾਂਗੋਨ, #E672002) ਵਿੱਚ 4% ਫਾਰਮਾਲਡੀਹਾਈਡ ਨਾਲ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।PBS ਨਾਲ ਤਿੰਨ ਵਾਰ ਧੋ ਕੇ ਸਥਿਰ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਵਾਧੂ ਫਾਰਮਾਲਡੀਹਾਈਡ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ 0.5% ਟ੍ਰਾਈਟਨ ਐਕਸ-100 (ਸਾਂਗੋਨ, #A600198) ਨਾਲ ਪਰਮੇਏਬਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ।ਫਿਰ ਚੈਂਬਰ ਨੂੰ ਹਟਾਓ ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ 25 µl ਇੱਕ ਕਲਿੱਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ਅਤੇ 0.5 mg/ml ਸੋਡੀਅਮ ਐਸਕੋਰਬੇਟ (Aladdin, no. S105024) ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਸਨੈਪ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ਵਾਲੇ PBS ਨਾਲ ਛੇ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਫਿਰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ PBST ਵਿੱਚ 5% BSA (Abcone, #B24726) ਨਾਲ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਕੋਲੋਕਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਇਮਯੂਨੋਸਟੇਨਿੰਗ ਲਈ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੰਕੇਤ ਸ਼ਰਤਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ: ਮਾਊਸ ਐਂਟੀ-ਵੀ5 ਟੈਗ mAb (1:500, CST, #80076), ਖਰਗੋਸ਼ ਐਂਟੀ-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), ਖਰਗੋਸ਼ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀ-ਕੈਲਨੇਕਸਿਨ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (1:500, ਐਬਕੈਮ, #ab22595) ਜਾਂ ਖਰਗੋਸ਼ ਐਂਟੀ-ਲਾਮਿਨ A/C ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (1:500; CST, #2032) ਰਾਤ ਨੂੰ 4 °C 'ਤੇ।PBST ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ: ਬੱਕਰੀ ਵਿਰੋਧੀ ਅਲੈਕਸਾ ਫਲੋਰ 488 (ਥਰਮੋ, #A11034) 1:1000 ਪਤਲਾ, ਬੱਕਰੀ ਵਿਰੋਧੀ ਮਾਊਸ ਅਲੈਕਸਾ ਫਲੋਰ 594 (CST, #8889) 1:100 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਪਤਲਾ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪਤਲਾ.ਫਿਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ PBST ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ PBS ਵਿੱਚ DAPI (ਥਰਮੋ, #D1306) ਨਾਲ ਕਾਊਂਟਰਸਟੇਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ 50% ਗਲਾਈਸਰੋਲ (ਸਾਂਗੋਨ, #A600232) ਵਿੱਚ ਸੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਮਯੂਨੋਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਚਿੱਤਰ ZEISS LSM 900 Airyscan2 ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਅਤੇ ZNE 3.5 ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ, ਹੈਂਕਸ HEPES ਬਫਰ (DOJINDO, #MT05) ਵਿੱਚ 100 nM Si-DMA ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਹੈਂਕਸ HEPES ਬਫਰ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਆਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ CO2 ਇਨਕਿਊਬੇਟਰ ਵਿੱਚ 45 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਿਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਹੈਂਕਸ ਦੇ HEPES ਬਫਰ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਹੈਂਕਸ ਦੇ HEPES ਬਫਰ ਵਿੱਚ Hoechst ਨਾਲ ਕਾਊਂਟਰਸਟੇਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ZEISS LSM 900 ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।, #M36008) ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਅਤੇ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਵਾਲੇ HBSS ਬਫਰ ਵਿੱਚ।ਰੋਸ਼ਨੀ ਜਾਂ ਡੌਕਸੋਰੂਬੀਸਿਨ (MCE, #HY-15142A) ਦੇ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਆਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ CO2 ਇਨਕਿਊਬੇਟਰ ਵਿੱਚ 37° C. ਉੱਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, HBSS ਬਫ਼ਰ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ HBSS ਬਫ਼ਰ ਵਿੱਚ Hoechst ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਮਿੰਟDoxorubicin ਨੂੰ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਜਾਂਚ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿੱਥੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ HBSS ਵਿੱਚ 20 μM ਡੌਕਸੋਰੁਬਿਸਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ 1% BSA ਸੀ।ਇਮਯੂਨੋਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਚਿੱਤਰ Zeiss LSM 900 ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ mito-miniSOG ਨੂੰ 15 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਦੇ ਪਕਵਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ 30% ਦੀ ਘਣਤਾ 'ਤੇ ਸੀਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।48 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ, ਜਦੋਂ ~80% ਸੰਗਮ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚ ਗਿਆ ਸੀ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਇੱਕ ਵਾਰ ਧੋ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਜ਼ੇ HBSS ਬਫਰ ਵਿੱਚ 1 ਐਮਐਮ ਪ੍ਰੋਬ 3 ਨਾਲ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ ਕਮਰੇ ਵਿੱਚ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਨੀਲੇ LED ਨਾਲ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਤਾਪਮਾਨ..ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, EDTA-ਮੁਕਤ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ (MCE, #HY-K0011) ਵਾਲੇ ਬਰਫ਼-ਠੰਡੇ ਪੀਬੀਐਸ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਸਕ੍ਰੈਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਮੁੜ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 1 ਮਿੰਟ (35% ਐਪਲੀਟਿਊਡ 'ਤੇ 1 ਸਕਿੰਟ ਚਾਲੂ ਅਤੇ 1 ਸਕਿੰਟ ਬੰਦ) ਲਈ ਟਿਪ ਨੂੰ ਸੋਨੀਕੇਟ ਕਰਕੇ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਮਲਬੇ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ 15,871 xg 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 4°C 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ BCA ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਸੇ ਕਿੱਟ (Beyotime, #P0009) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 4 mg/mL ਤੱਕ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਉਪਰੋਕਤ ਲਾਈਸੇਟ ਦੇ 1 ਮਿ.ਲੀ. ਨੂੰ 0.1 ਐਮਐਮ ਫੋਟੋਡੀਗਰੇਡੇਬਲ ਬਾਇਓਟਿਨ ਅਜ਼ਾਈਡ (ਕੰਫਲੂਓਰ, #BBBD-14), 1 ਐਮਐਮ ਟੀਸੀਈਪੀ (ਸਾਂਗੋਨ, #A600974), 0.1 ਐਮਐਮ ਟੀਬੀਟੀਏ ਲਿਗੈਂਡ (ਅਲਾਦੀਨ, #ਟੀ162437), ਅਤੇ 1 ਐਮਐਮ 4 ਐਮ ਸੀਯੂਬੀਏਟਰ ਨਾਲ ਮਿਲਾਓ। ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਘੁੰਮਾਓ।ਇੱਕ ਸਨੈਪ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ 10 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਕੱਚ ਦੀ ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੀ-ਮਿਕਸਡ ਘੋਲ (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) ਵਿੱਚ ਪਾਓ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 4500 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਹੇਠਲੇ ਅਤੇ ਉਪਰਲੇ ਘੋਲ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 1 ਮਿ.ਲੀ. ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ 2 ਵਾਰ ਧੁਆਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 15871×g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।25 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਅਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ (ਏ.ਬੀ.ਸੀ., ਅਲਾਦੀਨ, ਨੰ. ਏ110539) ਵਿੱਚ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ 8 ਐਮ ਯੂਰੀਆ (ਅਲਾਦੀਨ, ਨੰ. U111902) ਪਾਓ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਪੁਨਰਗਠਨ 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) ਨਾਲ 40 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 55°C 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 15mm ਤਾਜ਼ਾ ਆਇਓਡੋਏਸੀਟਾਮਾਈਡ (ਸਾਂਗੋਨ, #A600539) ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।30 ਮਿੰਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਅਲਕੀਲੇਸ਼ਨ..ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਾਧੂ 5 ਐਮਐਮ ਡਿਥੀਓਥਰੀਟੋਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਲਗਭਗ 100 µl ਨਿਊਟ੍ਰਾਵਿਡਿਨ ਐਗਰੋਸ ਬੀਡਜ਼ (ਥਰਮੋ, #29202) ਨੂੰ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋ ਕੇ ਤਿਆਰ ਕਰੋ।ਉਪਰੋਕਤ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਘੋਲ ਨੂੰ 5 ਮਿ.ਲੀ. ਪੀ.ਬੀ.ਐਸ. ਨਾਲ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਧੋਤੇ ਗਏ ਨਿਊਟ੍ਰਾਵਿਡਿਨ ਐਗਰੋਜ਼ ਮਣਕਿਆਂ ਨਾਲ ਪਕਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਿਰ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ 0.2% SDS (ਸਾਂਗੋਨ, #A600485) ਵਾਲੇ 5 ml PBS ਨਾਲ 3 ਵਾਰ, 1M ਯੂਰੀਆ ਵਾਲੇ 5 ml PBS ਨਾਲ 3 ਵਾਰ, ਅਤੇ 5 ml ddH2O ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ।ਮਣਕਿਆਂ ਦੀ ਫਿਰ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਕਟਾਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ 25 mM ABC ਦੇ 200 μl ਵਿੱਚ 1 M ਯੂਰੀਆ, 1 mM CaCl 2 (ਮੈਕਲਿਨ, #C805228) ਅਤੇ 20 ng/μl ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ (ਪ੍ਰੋਮੇਗਾ, #V5280) ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਰੋਟੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਰਾਤ ਭਰ ਟਰਾਈਪਸਿਨਾਈਜ਼ ਕਰੋ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ (ਥਰਮੋ, # A117-50) ਜੋੜ ਕੇ ਰੋਕ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਜਦੋਂ ਤੱਕ pH 2-3 ਤੱਕ ਨਹੀਂ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦਾ।ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ 0.2% ਐਸਡੀਐਸ ਵਾਲੇ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ, 1 ਐਮ ਯੂਰੀਆ ਵਾਲੇ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ, ਅਤੇ ਫਿਰ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਡਿਸਟਿਲਡ ਪਾਣੀ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ।ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਪੈਪਟਾਇਡਸ 70% MeOH ਦੇ 200 μl ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 90 ਮਿੰਟ ਲਈ ਲਾਈਟ ਲਾਈਸਿਸ (365 nm) ਦੁਆਰਾ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ.ਫਿਰ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ 70% MeOH ਦੇ 100 μl ਨਾਲ ਇੱਕ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟਾਂ ਨੂੰ ਪੂਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਪੀਡਵੈਕ ਵੈਕਿਊਮ ਕੰਸੈਂਟਰੇਟਰ ਵਿੱਚ ਸੁਕਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੱਕ -20 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਿੰਗਲਟ ਆਕਸੀਜਨ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਪੈਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਮੁੜ ਘੁਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਵਿਕਰੇਤਾ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਤੋਂ ਟਿਊਨ ਅਤੇ ਐਕਸਕੈਲੀਬਰ ਤੋਂ ਇੱਕ ਨੈਨੋ ESI ਸਰੋਤ ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲੂਮੋਸ ਟ੍ਰਿਬ੍ਰਿਡ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 1 μg ਪੈਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 75 µm × 15 cm ਅੰਦਰੂਨੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੈਕ ਕੀਤੇ ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਕਾਲਮ 'ਤੇ 3 µm C18 ਸਮੱਗਰੀ (ReproSil-pur, #r13.b9.) ਨਾਲ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ EASY-nLC 1200 UHPLC ਸਿਸਟਮ (ਥਰਮੋ) ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ।ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਲੀਨੀਅਰ 95 ਮਿੰਟ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦੁਆਰਾ 8% ਘੋਲਨ ਵਾਲਾ ਬੀ ਤੋਂ 50% ਘੋਲਨ ਵਾਲਾ ਬੀ (ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਏ = 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ, 80% ਐਸੀਟੋਨਿਟ੍ਰਾਈਲ ਵਿੱਚ ਬੀ = 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ ਰੇਖਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ 98% ਬੀ ਮਿੰਟ ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। 300 nl/ਮਿੰਟ ਦੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 'ਤੇ 6 ਮਿੰਟ ਵਿੱਚ।ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲੂਮੋਸ ਡੇਟਾ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਪੂਰੇ MS ਸਕੈਨ ਅਤੇ MS2 ਸਕੈਨ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਕਲਪਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡਾਟਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਸਪਟਰਿੰਗ ਵੋਲਟੇਜ ਨੂੰ 2.1 kV ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਆਇਨ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 320 ° C ਸੀ।MS ਸਪੈਕਟਰਾ (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, ਅਤੇ 150 ms ਦੇ ਅਧਿਕਤਮ ਇਨਪੁਟ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕੱਤਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਹਰੇਕ ਪੂਰੇ ਸਕੈਨ ਵਿੱਚ 10 ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਆਮ ਗੁਣਾ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਪੂਰਵਗਾਮੀ 30% ਦੀ ਇੱਕ ਸਧਾਰਣ ਟੱਕਰ ਊਰਜਾ, 1.6 m/z ਦੀ ਇੱਕ ਕੁਆਡਰੂਪੋਲ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਵਿੰਡੋ, ਅਤੇ 30,000 ਦੀ ਇੱਕ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਸੈਟਿੰਗ ਨਾਲ HCD ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਖੰਡਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।5×104 ਅਤੇ ਅਧਿਕਤਮ ਇਨਪੁਟ ਸਮਾਂ 150 ms ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਟੈਂਡੇਮ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਲਈ ਇੱਕ AGC ਟੀਚਾ।ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਅਪਵਾਦ 30 ਸਕਿੰਟਾਂ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। MS/MS ਲਈ ਅਸਾਈਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। MS/MS ਲਈ ਅਸਾਈਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS ਲਈ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਅਸਾਈਨ ਕੀਤੇ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਅਸਵੀਕਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS ਲਈ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਅਣ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਅਸਵੀਕਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਕੱਚੇ ਡੇਟਾ ਨੂੰ MSFragger 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ FragPipe ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਸੈਸ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਪੁੰਜ ਪੱਖਪਾਤ ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਾਂ ਨੂੰ -150 ਤੋਂ 500 Da ਦੇ ਪੂਰਵ-ਸੂਚਕ ਪੁੰਜ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਓਪਨ ਖੋਜ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ ਪੀਡੀ (ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਡਿਸਕਵਰ 2.5, ਥਰਮੋ) ਵਿੱਚ +229.0964 ਅਤੇ +247.1069 Da ਦੇ ਪੁੰਜ ਲਾਭਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਸੋਧਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ।
ਫਿਊਜ਼ਡ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਜੀਨ ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 6 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਦੇ ਪਕਵਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।~80% ਸੰਗਮ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚਣ 'ਤੇ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ HBSS (Gibco, #14025092) ਨਾਲ ਇੱਕ ਵਾਰ ਧੋ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਫਿਰ HBSS ਵਿੱਚ 37° C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਰਸਾਇਣਕ ਜਾਂਚਾਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨਾਲ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 20 ਮਿੰਟ ਲਈ 10W LED.ਇਹ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕਿ PDPL ਵਿੱਚ ਕਿਸ ਕਿਸਮ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਆਕਸੀਜਨ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, 0.5 mM ਵਿਟਾਮਿਨ C (MCE, #HY-B0166), 5 mM ਟ੍ਰੋਲਕਸ (MCE, #HY-101445), D2O (ਸਿਗਮਾ, #7789-20-0), 100 mM mannitol (ਊਰਜਾ ਰਸਾਇਣਕ, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ਪੂਰਕਾਂ ਵਜੋਂ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਠੰਡੇ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸਕ੍ਰੈਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 1.5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਜ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ EDTA ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ 1x ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ ਦੇ ਨਾਲ ਪੀਬੀਐਸ ਦੇ 200 μl ਵਿੱਚ 1 ਮਿੰਟ ਲਈ ਟਿਪ ਨਾਲ ਸੋਨਿਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (1 s ਅਤੇ 1 s ਬਿਨਾਂ, ਐਪਲੀਟਿਊਡ 35%)।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ 15,871 × g 'ਤੇ 4 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ BCA ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਸੈਸ ਕਿੱਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ 1 mg/mL ਤੱਕ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਉਪਰੋਕਤ ਲਾਈਸੇਟ ਦੇ ਲਗਭਗ 50 µl ਨੂੰ 0.1 mM ਰੋਡਾਮਾਇਨ ਅਜ਼ਾਈਡ (ਅਲਾਦੀਨ, ਨੰ. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ਅਤੇ 1 mM CuSO4 ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਹੇਠਾਂ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਵੱਲ ਘੁੰਮਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਕਲਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ 250 μl ਪ੍ਰੀ-ਚਿੱਲਡ ਐਸੀਟੋਨ ਜੋੜ ਕੇ, 20 ਮਿੰਟ ਲਈ -20 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਕੇ ਅਤੇ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 6010×g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜਿੰਗ ਕਰਕੇ ਐਸੀਟੋਨ ਨਾਲ ਵਰਖਾ ਕੀਤੀ ਗਈ।ਗੋਲੀ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ ਅਤੇ 50 µl 1x Laemmli ਦੇ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 95 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਉਬਾਲੋ।ਫਿਰ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ SDS-PAGE ਲੰਬੇ ਜੈੱਲਾਂ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ ਲੈਬ ਟਚ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੇ ਨਾਲ ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਚੀਮੀਡੌਕ ਐਮਪੀ ਟਚ ਇਮੇਜਿੰਗ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ miniSOG-6xHis ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, E. coli BL21(DE3) ਸੈੱਲਾਂ (TransGen, #CD701-02) ਨੂੰ pET21a-miniSOG-6xHis ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲ ਲਾਈਸਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ Ni-NTA ਐਗਰੋਜ਼ ਬੀਡਸ (MCE, ਨੰ. 70666) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, PBS ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਡਾਇਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ -80°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਐਂਟੀਬਾਡੀ-ਅਧਾਰਿਤ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਲੇਬਲ ਨੇੜਤਾ ਪਰਖ ਲਈ, PBS ਵਿੱਚ 100 μM ਸ਼ੁੱਧ miniSOG, 1 mM ਪੜਤਾਲ 3, ਅਤੇ 1 μg ਐਂਟੀ-ਲੇਬਲ ਮਾਊਸ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (TransGen, #HT501-01) ਨੂੰ 50 μl ਦੀ ਕੁੱਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਓ।.ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 0, 2, 5, 10, ਅਤੇ 20 ਮਿੰਟ ਲਈ ਨੀਲੀ LED ਲਾਈਟ ਨਾਲ ਕਿਰਨਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਉੱਪਰ ਵੱਲ ਮੋਸ਼ਨ ਸ਼ੇਕਰ 'ਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 0.1 mM ਬਾਇਓਟਿਨ-PEG3-ਅਜ਼ਾਈਡ (ਅਲਾਦੀਨ, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ਅਤੇ 1 mM CuSO4 ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ ਸਨੈਪ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਿੱਚ ਸਿੱਧੇ 4x ਲੇਮਮਲੀ ਦੇ ਬਫਰ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ ਅਤੇ 95 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਉਬਾਲੋ।SDS-PAGE ਜੈੱਲਾਂ 'ਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਐਚਆਰਪੀ (1:1000, ਸੋਲਰਬੀਓ, #SE068) ਨਾਲ ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
C-ਟਰਮੀਨਲ ਐਮੀਡੇਸ਼ਨ (LHDALDAK-CONH2) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ-ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੇੜਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡ-ਅਧਾਰਿਤ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਸ ਪਰਖ ਵਿੱਚ, 100 μM ਸ਼ੁੱਧ miniSOG, 10 mM ਪੜਤਾਲ 3 ਅਤੇ 2 μg/ml ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ 50 μl ਦੀ ਕੁੱਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ ਵਿੱਚ ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਨੀਲੀ LED ਲਾਈਟ ਨਾਲ ਕਿਰਨਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਇੱਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਲਿਟਰ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇੱਕ LC-MS ਸਿਸਟਮ (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight MassLynx ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਨਾਲ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਫਿਊਜ਼ਨ ਜੀਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਆਰਗੇਨੇਲ ਲੋਕਾਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ (ਮੀਟੋ, ਈਆਰ, ਨਿਊਕਲੀਅਸ) ਵਾਲੀਆਂ ਲਾਈਨਾਂ ਲਈ 10 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਦੇ ਪਕਵਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਅਤੇ ਪਾਰਕਿਨ-ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਅਤੇ ਬੀਆਰਡੀ4-ਮਿਨੀਐਸਓਜੀ ਲਾਈਨਾਂ ਲਈ 15 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਦੇ ਪਕਵਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸੀਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।~90% ਸੰਗਮ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚਣ 'ਤੇ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ HBSS ਨਾਲ ਇੱਕ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਫਿਰ HBSS ਵਿੱਚ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰੋਬ 3 ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਡਬਲਯੂ ਨੀਲੇ LED ਨਾਲ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਪਾਰਕਿਨ ਦੀ ਗੈਰ-ਸੰਪਰਕ ਲੇਬਲਿੰਗ ਲਈ, HBSS ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਬ 3 ਦੇ ਨਾਲ 10 µM ਪ੍ਰੋਟੋਨ ਕਾਰਬੋਨੀਲ ਸਾਇਨਾਈਡ ਕੈਰੀਅਰ m-ਕਲੋਰੋਫੇਨਿਲਹਾਈਡ੍ਰਾਜ਼ੋਨ CCCP (Solarbio, #C6700) ਨੂੰ 37°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲ ਲਾਈਸਿਸ, ਕਲਿੱਕ ਕੈਮਿਸਟਰੀ, ਰਿਡਕਸ਼ਨ ਅਤੇ ਅਲਕਾਈਲੇਸ਼ਨ ਸਟੈਪ ਉਹੀ ਸਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਸਿਵਾਏ ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਕਿ 2 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਲਾਈਸੇਟ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫੋਟੋਡਿਗਰੇਡੇਬਲ ਬਾਇਓਟਿਨ ਅਜ਼ਾਈਡ ਦੀ ਬਜਾਏ ਕਲਿੱਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਬਾਇਓਟਿਨ PEG3 ਅਜ਼ਾਈਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ 0.2% SDS ਵਾਲੇ 5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ, 1 ਐਮ ਯੂਰੀਆ ਵਾਲੇ 5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ, ਅਤੇ 5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ।ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 2 µg ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਨੂੰ 300 µl 25 mM ABC ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1 M ਯੂਰੀਆ 37°C 'ਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ।2-3 ਦੇ pH ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਤੱਕ ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਜੋੜ ਕੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਰੋਕ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮਣਕਿਆਂ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪੇਪਟਾਇਡ ਘੋਲ ਨੂੰ SOLAµ HRP ਕਾਲਮ (ਥਰਮੋ, #60209-001) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੀਸਲਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਪੀਡਵੈਕ ਵੈਕਿਊਮ ਕੰਸੈਂਟਰੇਟਰ ਵਿੱਚ ਸੁਕਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਮੁੜ ਘੁਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਗਏ ਨੈਨੋ-ਈਐਸਆਈ ਸਰੋਤ ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲੂਮੋਸ ਟ੍ਰਿਬ੍ਰਿਡ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 500 ਐਨਜੀ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਵਪਾਰਕ RP-HPLC ਪ੍ਰੀਕਾਲਮ (75 μm x 2 cm) (ਥਰਮੋ, ਨੰ. 164946) ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਤਮਕ RP-HPLC ਕਾਲਮ (75 μm x 25 cm) (ਥਰਮੋ, ਨੰ. 164941) 'ਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਦੋਵੇਂ 2 μm ਨਾਲ ਭਰੇ ਹੋਏ ਸਨ।60 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 8% ਤੋਂ 35% ACN ਤੱਕ ਗਰੇਡੀਐਂਟ, ਫਿਰ 300 Nl/min ਦੀ ਵਹਾਅ ਦਰ 'ਤੇ 6 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਰੇਖਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ 98% B ਤੱਕ ਵਧਿਆ।MS ਸਪੈਕਟਰਾ (350-1500 m/z) ਨੂੰ 60,000, AGC 4 × 105, ਅਤੇ 50 ms ਦੇ ਅਧਿਕਤਮ ਇਨਪੁਟ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ HCD ਦੁਆਰਾ 3 s ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ 30% ਦੀ ਇੱਕ ਸਧਾਰਣ ਟੱਕਰ ਊਰਜਾ, 1.6 m/z ਦੀ ਇੱਕ ਕੁਆਡਰੂਪੋਲ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਵਿੰਡੋ, ਅਤੇ 15000 ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਨਾਲ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਖੰਡਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ 5 × 104 ਟੈਂਡੇਮ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ AGC ਟੀਚਾ ਅਤੇ ਅਧਿਕਤਮ ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਸਮਾਂ 22 ਐਮਐਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਬੇਦਖਲੀ ਨੂੰ 45 ਸਕਿੰਟਾਂ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। MS/MS ਲਈ ਅਸਾਈਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। MS/MS ਲਈ ਅਸਾਈਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS ਲਈ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਅਸਾਈਨ ਕੀਤੇ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਅਸਵੀਕਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS ਲਈ 1+ ਅਤੇ >7+ ਦੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਅਣ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਅਸਵੀਕਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਨਿਊਟ੍ਰਾਵਿਡਿਨ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਤੱਕ ਨਮੂਨਾ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੇ ਪੜਾਅ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਗਏ LC-MS/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ।ਲਗਭਗ 50 μg lysate ਨੂੰ ਲੋਡਿੰਗ ਨਿਯੰਤਰਣ ਲਈ ਇੰਪੁੱਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 2 mg lysate ਨੂੰ ਕਲਿੱਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਿਊਟ੍ਰਾਵਿਡਿਨ ਨਾਲ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਅਤੇ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਬਾਊਂਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਐਗਰੋਜ਼ ਰੈਜ਼ਿਨ ਮਣਕਿਆਂ ਵਿੱਚ 50 μl ਲੈਮਮਲੀ ਦੇ ਬਫਰ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ ਅਤੇ 95 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਉਬਾਲ ਕੇ ਬਾਹਰ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ।ਕੰਟਰੋਲ ਲੋਡ ਇਨਪੁਟ ਅਤੇ ਬੀਡ ਐਨਰਿਚਡ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਮਿਆਰੀ ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟ ਵਿਧੀਆਂ ਦੁਆਰਾ PVDF ਝਿੱਲੀ (ਮਿਲੀਪੋਰ, #ISEQ00010) ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਟੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ 5% ਸਕਿਮ ਮਿਲਕ (ਸਾਂਗੋਨ, #A600669) ਨਾਲ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 0.1% ਟਵਿਨ-20 (TBST) ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨੂੰ TBST ਵਿੱਚ 5% ਸਕਿਮ ਦੁੱਧ ਵਿੱਚ 1:1000 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਰਾਤ ਨੂੰ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ 1:5000 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਕੈਮੀਡੋਕ ਐਮਪੀ ਇਮੇਜਿੰਗ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਕੈਮੀਲੁਮਿਨਿਸੈਂਸ ਦੁਆਰਾ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਬਲੌਟਸ ਅਤੇ ਜੈੱਲਾਂ ਦੇ ਸਾਰੇ ਅਣਕੱਟੇ ਹੋਏ ਸਕੈਨ ਕੱਚੇ ਡੇਟਾ ਵਜੋਂ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਵਿੱਚ ਖਰਗੋਸ਼ ਵਿਰੋਧੀ SFPQ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (CST, ਨੰ. 71992), ਖਰਗੋਸ਼ ਵਿਰੋਧੀ FUS ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (CST, ਨੰ. 67840), ਖਰਗੋਸ਼ ਵਿਰੋਧੀ NSUN2 ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ, ਨੰ. 20854-1-) ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ। AP), ਖਰਗੋਸ਼ ਵਿਰੋਧੀ mSin3A ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (Abcam, #ab3479), ਮਾਊਸ ਐਂਟੀ-ਟੈਗ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਟਰਾਂਸਜੇਨ, #HT201-02), ਮਾਊਸ ਐਂਟੀ-β-ਐਕਟਿਨ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਟਰਾਂਸਜੇਨ, #HC201-01), ਖਰਗੋਸ਼ ਵਿਰੋਧੀ -CDK2 ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ABclonal, #A0094), ਖਰਗੋਸ਼ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਤੋਂ CTBP1 (ABclonal, #A11600), ਖਰਗੋਸ਼ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਤੋਂ DUT (ABclonal, #A2901), ਖਰਗੋਸ਼ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਤੋਂ PSMC4 (ABclonal, #A2505), ਐਂਟੀਬਾਡੀ DNAJB1 ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ABclonal, # A5504)।ਇਹ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ TBST ਵਿੱਚ 5% ਸਕਿਮ ਦੁੱਧ ਵਿੱਚ 1:1000 ਪਤਲੇ ਹੋਣ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਵਿੱਚ 1:5000 ਪਤਲੇਪਣ 'ਤੇ ਐਂਟੀ-ਰੈਬਿਟ IgG (TransGen, #HS101-01), ਐਂਟੀ-ਮਾਊਸ IgG (TransGen, #HS201-01) ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ।
ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ BRD4 SFPQ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਸਥਿਰ HEK293T ਅਤੇ BRD4-miniSOG ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ HEK293T ਨੂੰ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਕਰਨ ਵਾਲੇ 10 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਦੇ ਪਕਵਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਠੰਡੇ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ EDTA-ਮੁਕਤ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨਾਲ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪੀਅਰਸ ਆਈਪੀ ਲਾਇਸਿਸ ਬਫਰ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ, #87787) ਵਿੱਚ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਉਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਲਾਈਸੈਟਸ ਨੂੰ 1.5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 4°C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 15,871 xg 'ਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਦੀ ਕਟਾਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ 5 µg ਐਂਟੀ-V5 ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਮਾਊਸ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (CST, #80076) ਨਾਲ ਰਾਤ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਲਗਭਗ 50 μl ਪ੍ਰੋਟੀਨ A/G ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕੇ (MCE, #HY-K0202) ਨੂੰ ਦੋ ਵਾਰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਧੋਵੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 0.5% ਟਵੀਨ-20 ਹੈ।ਫਿਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਸੈਟਸ ਨੂੰ ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਨਾਲ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਹੇਠਾਂ ਤੋਂ ਸਿਖਰ ਤੱਕ ਘੁੰਮਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਸੀ।ਫਿਰ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ PBST ਬਫਰ ਦੇ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਨਾਲ ਚਾਰ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 95 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਉਬਾਲਿਆ ਗਿਆ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ SDS-PAGE ਜੈੱਲਾਂ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਮਿਆਰੀ ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ PVDF ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ TBST ਵਿੱਚ 5% ਸਕਿਮ ਦੁੱਧ ਵਿੱਚ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਰੈਬਿਟ ਐਂਟੀ-SFPQ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (CST, #71992) ਦੀ ਵਰਤੋਂ TBST ਵਿੱਚ 5% ਸਕਿਮ ਦੁੱਧ ਵਿੱਚ 1:1000 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਰਾਤ ਨੂੰ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਐਂਟੀ-ਰੈਬਿਟ ਆਈਜੀਜੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 1:5000 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕੈਮੀਡੋਕ ਐਮਪੀ ਇਮੇਜਿੰਗ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਕੈਮੀਲੁਮਿਨਿਸੈਂਸ ਦੁਆਰਾ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸੌਲਵੈਂਟ ਐਕਸੈਸੀਬਲ ਸਰਫੇਸ ਏਰੀਆ (SASA) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤੀਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਬਣਤਰਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੇਟਾ ਬੈਂਕ (PDB)52 ਜਾਂ ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਟ੍ਰਕਚਰ ਡੇਟਾਬੇਸ53 ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ।FreeSASA ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਹਰੇਕ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਲਈ ਸੰਪੂਰਨ SASA ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਗੁਆਂਢੀਆਂ ਲਈ ਕੇਵਲ ਸੰਪੂਰਨ ਅਤੇ ਅਸਪਸ਼ਟ SASA ਡੇਟਾ ਹਰੇਕ ਢਾਂਚੇ ਲਈ ਔਸਤ SASA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਹਰੇਕ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਲਈ ਸਾਪੇਖਿਕ ਘੋਲਨਸ਼ੀਲ ਪਹੁੰਚਯੋਗਤਾ (RSA) ਦੀ ਗਣਨਾ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਲਈ ਉਪਲਬਧ ਅਨੁਭਵੀ ਅਧਿਕਤਮ ਸੰਭਵ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਸਤਹ ਖੇਤਰ ਦੁਆਰਾ ਸੰਪੂਰਨ SASA ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਵੰਡ ਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸਾਰੇ ਹਿਸਟੀਡਾਈਨਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ ਲੁਕਵੇਂ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸ਼੍ਰੇਣੀਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੇਕਰ ਔਸਤ RSA 20% ਤੋਂ ਘੱਟ ਸੀ, ਨਹੀਂ ਤਾਂ 56.
ਡੀਡੀਏ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀਆਂ ਕੱਚੀਆਂ ਫਾਈਲਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਡਿਸਕਵਰਰ (v2.5) ਜਾਂ MSfragger (Fragpipe v15.0) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਉਚਿਤ SwissProt ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੇਟਾਬੇਸ ਵਿੱਚ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਆਮ ਗੰਦਗੀ ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ।ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਦੋ ਗੁੰਮ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪੂਰੀ ਟ੍ਰਿਪਸਿਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਸੋਧ ਵਜੋਂ ਕਾਰਬਾਮੋਇਲ ਮੈਥਾਈਲੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਸੋਧ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ ਆਕਸੀਕਰਨ।ਪ੍ਰੀਕਰਸਰ ਅਤੇ ਫਰੈਗਮੈਂਟ ਵਜ਼ਨ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 10 ppm ਅਤੇ 0.02 Da (MS2 Orbitrap) 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਦੂਸ਼ਿਤ ਹਿੱਟਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ <1% ਦੀ ਝੂਠੀ ਖੋਜ ਦਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਦੂਸ਼ਿਤ ਹਿੱਟਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ <1% ਦੀ ਝੂਠੀ ਖੋਜ ਦਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обяна %. ਦੂਸ਼ਿਤ ਹਿੱਟਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ <1% ਦੀ ਗਲਤ ਖੋਜ ਦਰ ਦੇਣ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1% 的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений %.1 ਦੂਸ਼ਿਤ ਹਿੱਟਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ <1% ਦੀ ਗਲਤ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਦਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਲੇਬਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਤਿੰਨ ਜੈਵਿਕ ਦੁਹਰਾਓ ਤੋਂ ਆਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਬਸੈਲੂਲਰ ਲੋਕਾਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ DAVID ਬਾਇਓਇਨਫੋਰਮੈਟਿਕਸ ਰਿਸੋਰਸਜ਼, ਮਿਟੋਕਾਰਟਾ 3.0 ਅਤੇ ਐਲਿਸ ਟਿੰਗ ਸਮੂਹ ਦੁਆਰਾ ਸੰਕਲਿਤ ਅਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਡੇਟਾਬੇਸ ਤੋਂ ਜੀਨ ਓਨਟੋਲੋਜੀ (GO) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਜੁਆਲਾਮੁਖੀ ਦਾ ਨਕਸ਼ਾ ਪਰਸੀਅਸ (v1.6.15.0) ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਭਰਪੂਰਤਾ ਫੋਲਡ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਦੋ-ਪਾਸੜ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਮਹੱਤਤਾ ਲਈ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹਿੱਟ ਦੀ ਪਛਾਣ ਭਰਪੂਰਤਾ ਤਬਦੀਲੀ >2 (ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਨਹੀਂ ਕਿਹਾ ਗਿਆ) ਅਤੇ p ਮੁੱਲ <0.05 ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਭਰਪੂਰਤਾ ਫੋਲਡ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਦੋ-ਪਾਸੜ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਮਹੱਤਤਾ ਲਈ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹਿੱਟ ਦੀ ਪਛਾਣ ਭਰਪੂਰਤਾ ਤਬਦੀਲੀ >2 (ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਨਹੀਂ ਕਿਹਾ ਗਿਆ) ਅਤੇ p ਮੁੱਲ <0.05 ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮਗਰੀ ਫੋਲਡ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਦੋ-ਟੇਲਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਮਹੱਤਤਾ ਲਈ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮੈਚਾਂ ਨੂੰ ਸਮੱਗਰੀ ਤਬਦੀਲੀ >2 (ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਨੋਟ ਨਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੋਵੇ) ਅਤੇ AP ਮੁੱਲ <0.05 ਨਾਲ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।使用 双边 双边双边 测试测试 丰度丰度 倍数 变化倍数 的, 并 确定 蛋白质 命 中 的的> 2 (除非除非 说明) 和 ਪੀ 值 <0.05.使用 双边双边 t 检验 测试 倍倍 数 变化 变化 变化显着性> 2 (另 有) 和 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਮਗਰੀ ਵਿੱਚ ਫੋਲਡ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮੈਚਾਂ ਨੂੰ ਸਮੱਗਰੀ ਤਬਦੀਲੀਆਂ >2 (ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਸੰਕੇਤ ਨਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੋਵੇ) ਅਤੇ p-ਮੁੱਲ <0.05 ਲਈ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਟ੍ਰਿੰਗ ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੇ ਨਾਲ GO ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਮਾਨ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਤਿੰਨ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ।ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ (ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ ਸੌਫਟਵੇਅਰ) ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪਰਸੀਅਸ (v1.6.15.0) ਨਾਲ ਜੁਆਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਦੋ ਸਮੂਹਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, p-ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਵਾਰ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਸਿੰਗਲਟਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਕੰਟਰੋਲ ਗਰੁੱਪ ਵਿੱਚ ਸੰਬੰਧਿਤ ਗੁੰਮ ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਆਮ ਵੰਡ ਤੋਂ ਪਰਸੀਅਸ ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਪੀ-ਮੁੱਲ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕੇ।ਗਲਤੀ ਪੱਟੀਆਂ ਮੱਧਮਾਨ ± ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਂ ਵਿੱਚ, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਭਰਪੂਰਤਾ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਆਕਾਰ ਨੂੰ ਪੂਰਵ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਅੰਕੜਾ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰਯੋਗ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਨਹੀਂ ਹਨ।ਖੋਜਕਰਤਾ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਅਤੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਦੌਰਾਨ ਕੰਮਾਂ ਲਈ ਅੰਨ੍ਹੇ ਨਹੀਂ ਸਨ।
ਅਧਿਐਨ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਬਾਰੇ ਵਧੇਰੇ ਜਾਣਕਾਰੀ ਲਈ, ਇਸ ਲੇਖ ਨਾਲ ਲਿੰਕ ਕੀਤੀ ਕੁਦਰਤ ਖੋਜ ਰਿਪੋਰਟ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਦੇਖੋ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟਰੋਮੈਟਰੀ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਡੇਟਾਸੈਟ ID PXD034811 (PDPL-MS ਡੇਟਾਸੈਟ) ਦੇ ਤਹਿਤ iProX57 ਸਹਿਭਾਗੀ ਰਿਪੋਜ਼ਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਐਕਸਚੇਂਜ ਕੰਸੋਰਟੀਅਮ ਨੂੰ ਜਮ੍ਹਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਲੇਖ ਅਸਲੀ ਡਾਟਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ਆਂਢ-ਗੁਆਂਢ ਨੂੰ ਜਾਣਨਾ: ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਅਤੇ ਮੈਪ ਆਰਗੇਨੇਲਸ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਨੇੜਤਾ-ਨਿਰਭਰ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ। Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ਆਂਢ-ਗੁਆਂਢ ਨੂੰ ਜਾਣਨਾ: ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਅਤੇ ਮੈਪ ਆਰਗੇਨੇਲਸ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਨੇੜਤਾ-ਨਿਰਭਰ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ।Gingras, AS, Abe, KT ਅਤੇ Raut, B. ਆਲੇ-ਦੁਆਲੇ ਦੇ ਨਾਲ ਜਾਣ-ਪਛਾਣ: ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਅਤੇ ਮੈਪ ਆਰਗੇਨੇਲਸ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਨੇੜਤਾ-ਨਿਰਭਰ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ। Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ਆਂਢ-ਗੁਆਂਢ ਨੂੰ ਸਮਝਣਾ: ਜੈਵਿਕ ਜੀਵਨ 'ਤੇ ਗੁਆਂਢ ਦੀ ਨਿਰਭਰਤਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।Gingras, AS, Abe, KT ਅਤੇ Raut, B. ਨੇੜਤਾ ਨੂੰ ਸਮਝਣਾ: ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਨੇੜਤਾ-ਨਿਰਭਰ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅੰਗਾਂ ਦੀ ਮੈਪਿੰਗ।ਵਰਤਮਾਨ।ਮੇਰੀ ਰਾਏ.ਕੈਮੀਕਲ.ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ 48, 44–54 (2019)।
ਗੇਰੀ, ਜੇਬੀ ਐਟ ਅਲ.ਡੈਕਸਟਰ ਊਰਜਾ ਨੂੰ ਇਮਿਊਨ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਕੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋ ਐਨਵਾਇਰਮੈਂਟ ਦਾ ਮੈਪਿੰਗ।ਵਿਗਿਆਨ 367, 1091–1097 (2020)।
ਹਰਟਲਿੰਗ, EL et al.ਦੋ-ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਸਕੇਲ ਨੈਟਵਰਕ ਮਨੁੱਖੀ ਇੰਟਰਐਕਟੋਮ ਦੇ ਸੈੱਲ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਰੀਮਡਲਿੰਗ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਸੈੱਲ 184, 3022–3040.e3028 (2021)।
ਪੋਸਟ ਟਾਈਮ: ਸਤੰਬਰ-15-2022
